氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定復(fù)合調(diào)味料中的微量苯甲酸

王祖翔 周洪斌 蔣 俊 沈 波

（江蘇鎮(zhèn)江出入境檢驗檢疫局，江蘇 鎮(zhèn)江 212008）

氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定復(fù)合調(diào)味料中的微量苯甲酸

王祖翔 周洪斌 蔣 俊 沈 波

（江蘇鎮(zhèn)江出入境檢驗檢疫局，江蘇 鎮(zhèn)江 212008）

建立高鹽高氨基酸復(fù)合調(diào)味料中微量苯甲酸的氣相色譜毛細管色譜柱檢測方法。調(diào)節(jié)樣品水溶液至酸性而改變其在有機相和水相中分配比。用乙醚高速勻漿的方法多次提取，去除鹽類和氨基酸等雜質(zhì)后濃縮。苯甲酸用氣相色譜毛細管色譜柱分離，F(xiàn)ID檢測器定量檢測，質(zhì)譜定性。結(jié)果表明：該方法在2.0～60.0mg/L的線性關(guān)系為R2＞0.999，最低檢 測 限 （LOD）達 到 1.0mg/kg，定 量 限 （LOQ）為3.0mg/kg，檢出限加標(biāo)回收率在89.0%～99.2%，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＜5%。說明該方法具有高靈敏性和專屬性，能對微量苯甲酸進行準(zhǔn)確定性和定量檢測，是行之有效的檢測方法。

氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用；苯甲酸；復(fù)合調(diào)味料

苯甲酸是最常用的防腐劑之一，在一定條件下能對霉菌和酵母菌的繁殖起到抑制作用，起到延長食品保存時間的功效，是大多數(shù)國家允許使用的食品防腐劑，但過量食用對人體有害，因而，許多國家的食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)都規(guī)定了最大允許使用量［1］。在進出口貿(mào)易中，日本等國家對苯甲酸的限量要求極為苛刻，僅為1mg/kg。中國GB 2760——2007規(guī)定，復(fù)合調(diào)味料中苯甲酸的最大使用限量為600mg/kg［2］。GB/T 23495——2009方法規(guī) 定 的 苯 甲 酸 檢 測 限 為 1.8mg/kg［3］；GB/T 5009.29——2003方法規(guī)定的苯甲酸的檢測限為1mg/kg［4］。

當(dāng)前，國內(nèi)外測定防腐劑的方法有很多，如光譜法、毛細管電泳法、離子色譜法、分光光度法等［5－9］，使用最多的是色譜法，并有大量文獻報道［10－13］，但未見復(fù)合調(diào)味料中低含量苯甲酸檢測的相關(guān)資料。復(fù)合調(diào)味料基質(zhì)復(fù)雜，含高鹽高氨基酸，干擾嚴(yán)重，檢出限遠高于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，且極易出現(xiàn)假陽性，不能滿足低殘留量苯甲酸的檢測要求，必須經(jīng)質(zhì)譜定性。許秀敏等［14］曾報道液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀進行定性分析，液相色譜紫外檢測器進行定量分析。本試驗基于2010年度中國進出口食品安全衛(wèi)生殘留計劃中對復(fù)合調(diào)味料中苯甲酸的檢測要求，使用氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀，F(xiàn)ID定量檢測，并用質(zhì)譜進行定性確證。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

石油醚，乙醚，無水硫酸鈉，氯化鈉，鹽酸：分析純，南京化學(xué)試劑一廠；

水：一級水，優(yōu)普超純水機制備；

衍生化試劑：雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）＋三甲基氯硅烷（TMCS）（99＋1），美國REGIS公司；

苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99%，德國Dr Ehrenstorfer公司。

1.2 試驗儀器

7890N氣相色譜儀配氫火焰離子化檢測器（FID）－串聯(lián)5975CInert MS質(zhì)譜：美國Agilent公司；

旋渦混勻器：XW－80A，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：BuCHI R－200，瑞士BuCHI公司；

臺式高速冷凍離心機：H2050R，湖南湘儀離心機儀器有限公司；

高純度氫氣發(fā)生器：SJPH－300A，北京中惠普分析技術(shù)研究所；

超純水機：UPH－IV－20T，南京優(yōu)普環(huán)保設(shè)備有限公司；

氮吹儀：TuboVap LV，美國Caliper公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 FID定量 色譜柱：HP－innowax（30m×0.25mm×0.25μm）；氮氣流速：1mL/min；進樣口溫度：250℃；檢測器溫度：250℃；柱溫：100℃保持1min，40℃/min升至180℃保持2min，10℃/min升至230℃保持2min，10℃/min升至240℃保持2min，10℃/min升至250℃保持10min。進樣方式：分流；分流比：20∶1。進樣量：1μL。

1.3.2 MSD定性確證

（1）色譜條件：色譜柱：DB－5MS UI（30m×0.25mm×0.25μm）；氦氣流速：1mL/min；進樣口溫度：260℃；柱溫：80℃保持3min，30℃/min升至300℃保持2min；接口溫度：280℃；進樣方式：不分流；進樣量：1μL。

（2）質(zhì)譜條件：離子源：150℃，四級桿：230℃，scan模式全掃描，溶劑延時5min。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品各0.100 0g，石油醚＋乙醚（3＋1）混合溶劑溶解，定容至100mL，此混合溶液每毫升相當(dāng)于1.0mg苯甲酸。再移取10mL濃度為1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液于100mL容量瓶中石油醚＋乙醚（3＋1）混合溶劑定容，如此稀釋成10μg/mL的苯甲酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取2.0，5.0，10.0，20.0，40.0，60.0mL濃度為10μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL容量瓶中，石油醚＋乙醚（3＋1）混合溶劑定容，得到2.0，5.0，10.0，20.0，40.0，60.0μg/mL不同濃度梯度苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

1.3.4 樣品處理 準(zhǔn)確稱取5.0g試樣，置于50mL聚四氟乙烯離心管中，加鹽酸（1＋1）酸化，調(diào)節(jié)pH值1到2之間，用20mL乙醚渦旋提取1min，4 000r/min離心5min，收集乙醚層于30mL玻璃試管中，40℃水浴上氮氣吹干。再用20mL乙醚渦旋提取1min，4 000r/min離心5min，收集乙醚層于同一玻璃試管中，40℃水浴上氮氣吹干。用10mL乙醚，將30mL玻璃管中殘渣洗入10mL玻璃試管中，40℃水浴上氮氣吹干。準(zhǔn)確移入1mL石油醚＋乙醚（3＋1）混合溶劑溶解殘渣，得到待測液。

1.3.5 樣品測定 按照1.3.4進行樣品前處理，1.3.1和1.3.2條件進行定量測定和定性確證。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性回歸方程

對濃度為5.0，10.0，20.0，40.0，60.0，80.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行分析（標(biāo)準(zhǔn)品分離色譜圖見圖1），得到質(zhì)量濃度X與峰面積Y的工作曲線，線性與相關(guān)系數(shù)良好?；貧w方程為：Y＝47 923X－28 805；線性相關(guān)系數(shù)R2＝0.999 6。苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間：10.941min。

圖1 實際樣品局部色譜圖（FID）Figure 1 Partial chromatogram of real samples（FID）

2.2 檢測低限

按色譜峰高是基線噪聲高度3倍為有效信號計算檢出限（LOD），在本試驗條件下，苯甲酸的檢出限為1mg/kg；基線噪聲高度10倍為有效信號計算定量限（LOQ），在本試驗條件下，苯甲酸的定量限為3mg/kg。

2.3 加標(biāo)回收試驗和精密度計算

將待測樣品和加標(biāo)樣品進行6次試驗，對所得的試驗結(jié)果計算精密度，具體結(jié)果見表1，樣品色譜圖見圖1。

表1 苯甲酸在不同添加水平下的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Recoveries and RSDs of benzoic acid spiked at differentl evels（n＝6）

采用加標(biāo)測定回收率的方法來計算準(zhǔn)確度。將濃度適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液按本試驗所述方法進行測定，回收率為80%～98%。

2.4 前處理優(yōu)化

苯甲酸為弱酸，pKa值為4.76，在酸性條件下（pH在1到2之間），以酸的形式存在，易溶于石油醚和乙醚。復(fù)合調(diào)味料基質(zhì)復(fù)雜，提取過程中需加入酸來抑制電離，減少在水相中的分配比。按GB/T 5009.29——2003第一法所用的鹽酸量不足以使試樣呈酸性，苯甲酸在電離狀態(tài)下在水相中溶解度較大，嚴(yán)重降低乙醚萃取效率，故本試驗加大鹽酸溶液用量，最終以調(diào)節(jié)試樣溶液pH值來決定鹽酸溶液用量。

2.5 質(zhì)譜定性試驗

按1.3.4處理的待測液，用1.3.2的色譜和質(zhì)譜條件進行試驗，從總離子流圖中提取122、105、77、51四離子，得到提取離子色譜圖（圖2），扣除背景后得到質(zhì)譜圖（圖3）與標(biāo)準(zhǔn)譜庫中的苯甲酸匹配度為98%。

圖2 樣品提取離子色譜圖Figure 2 Extracted ion chromatograms

圖3 提取離子的質(zhì)譜圖Figure 3 Extracted ion mass spectrum

2.6 柱前硅烷化衍生

甘平勝等［15］利用質(zhì)譜的高靈敏度和高選擇性，直接對奶粉中低含量殘留的苯甲酸定性定量。在質(zhì)譜定性確證試驗中，還發(fā)現(xiàn)部分苯甲酸被硅烷化后的產(chǎn)物。試驗結(jié)果表明苯甲酸的羥基氫活性較強，有可能被毛細管柱填料的硅烷基取代，峰型嚴(yán)重拖尾、重復(fù)性和線性相關(guān)性很差，難以準(zhǔn)確定量。

取10μg/mL苯甲酸標(biāo)品溶液100μL，氮氣吹干，加入300μL吡啶和200μL衍生化試劑，70℃水浴反應(yīng)40min，供GC－MSD檢測。色譜條件：色譜柱：HP－5MS（30m×250μm ×0.25μm）；柱溫：110℃保持4min，30℃/min升至180℃保持3min；氦氣流速：1mL/min；進樣口溫度：280℃；接口溫度：280℃；進樣方式：不分流；進樣量：1μL。硅烷化后的特征離子有179、135、105、77、121等，峰形有較大改善，靈敏度提高，重復(fù)性良好，可以建立為痕量苯甲酸殘留的定量檢測方法，提取離子圖和質(zhì)譜圖見圖4和圖5。

圖4 衍生后的提取離子色譜圖Figure 4 Extracted ion chromatograms of derivatized

圖5 衍生后的質(zhì)譜圖Figure 5 Mass spectrum of derivatized

3 結(jié)論

本試驗基于氣相色譜法檢測苯甲酸的基礎(chǔ)上，對前處理優(yōu)化，建立了一種高效、快速的利用氣相色譜法檢測復(fù)合調(diào)味料中苯甲酸微量殘留的檢測方法，并使用質(zhì)譜進行定性確證，防止了假陽性的產(chǎn)生。該方法有效解決了基質(zhì)復(fù)雜，高鹽高氨基酸樣品中微量苯甲酸殘留的檢測困難，其精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性都可以滿足日常檢測工作的需要，適宜其他樣品的日常檢測。

1 張紅，陳子雷，王文博，等.肉制品中山梨酸、苯甲酸的氣相色譜分析方法的研究［J］.食品科技，2007（2）：234.

2 中華人民共和國衛(wèi)生部.GB2760——2007食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

3 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T 23495——2009食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定 高效液相色譜法［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

4 中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T5009.129——2003食品中山梨酸、苯甲酸的測定［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.

5 Campos C，Gerschenson L N，Alzamora S M，et al.Determination of sorbic acid in raw beef：An improved procedure［J］.Food Sci，1991，56（3）：863.

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8 Xie Y T，Chen P，Wei W Z.Rapid analysis of preservatives in beverages by ion chromatography with series piezoelectric quartz crystal as aetector［J］.Microchem，1999，61（1）：58～68.

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11 Techakriengkrai I，Surakarnkul R.Analysis of benzoic acid and sorbic acid in Thai rice wines and distillates by solid－phase sorbent extraction and high－performance liquid chromatography［J］.Food Compos Anal.，2007，20（3）：220～225.

12 陳子雷，張紅，王文博，等.氣相色譜法測定糕點中山梨酸和苯甲酸的含量［J］.食品與藥品，2006，11（8）：52～54.

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15 甘平勝，黃聰，于鴻，等.氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法測定奶粉中苯甲酸（鈉）含量［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2008，18（1）：75～76.

Study on the trace determination of benzoic acid in compound seasoning powder by gas chromatography－tandem mass spectrometry

WANG Zu－xiang ZHOU Hong－bin JIANG JunSHEN Bo

（Zhenjiang Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhenjiang，Jiangsu212008，China）

To establish a method of capillary gas chromatography for the determination of benzoic acid in compound seasoning powder which contain high concentrations of salts and amino acids.Change the distribution ratio of samples in the organic phase and water by adjusting the solution to acidic.The sample was mashed several times at a high speed，and extracted with diethyl ether then concentrated after removed impurities such as salts and amino acid.Benzoic acid was separated by GC with capillary column，detected quantitatively by FID and identified by mass.Within the concentrations of 2.0～60.0mg/L，the calibration curve showed good linearity with the correlation coefficient（R2）＞0.998.The limit of detection（LOD）was 1.0mg/kg，while the limit of quantification（LOQ）3.0mg/kg.At the spiked levels of LOD，the recovery rate was 89.0%～99.2%.The relative standard deviation range of samples added standard substance was（RSD）＜5%.This method is sensitive and special features in identify and determination of trace benzoic acid.It is a feasible method.

GC－MSD；benzoic acid；compound seasoning powder

10.3969/j.issn.1003－5788.2011.03.026

王祖翔（1983－），男，江蘇鎮(zhèn)江出入境檢驗檢疫局助理工程師。E－mail：wang＿zuxiang＠163.com

2011－03－11