酯型茶黃素酶促降解條件的優(yōu)化

蔡少華 劉仲華 黃建安 王坤波

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

酯型茶黃素酶促降解條件的優(yōu)化

蔡少華 劉仲華 黃建安 王坤波

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

比較單寧酶、脂肪酶、豬胰脂肪酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、糖化酶、果膠酶和α－淀粉酶對(duì)酯型茶黃素（TFDG）的水解效果，并對(duì)最佳水解酶的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，單寧酶水解酯型茶黃素的效果最好，其反應(yīng)最佳條件為反應(yīng)體系的溫度40℃、pH 值5.0、酶濃度2.4mg/mL、最佳反應(yīng)時(shí)間120min。水解后茶黃素中簡(jiǎn)單茶黃素（TF）的含量從52.51mg/g提高到199.84mg/g。

茶黃素；水解酶；單寧酶

茶黃素（theaflavins，TFs）是紅茶加工過(guò)程中兒茶素類酶促氧化縮合形成的一類色素，與紅茶品質(zhì)高度相關(guān)，紅茶中茶黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)0.5%～3%。TFs是一類能溶于乙酸乙酯、具有苯并卓酚酮結(jié)構(gòu)的化合物的總稱［1］。目前已發(fā)現(xiàn)并鑒定的茶黃素有25種，其中最主要的4種分別為TF、TF－3－G、TF－3’－G和 TFDG。其中 TF由于化學(xué)結(jié)構(gòu)中不含沒(méi)食子酰基，被稱為簡(jiǎn)單茶黃素，后3種茶黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)或兩個(gè)沒(méi)食子酰基，被稱為酯型茶黃素，4種茶黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 4種主要茶黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1 The chemical structure of four main theaflavins

現(xiàn)已證實(shí)，茶黃素具有較好的抗氧化、降脂、降膽固醇和抗腫瘤作用［2－6］。不同的茶黃素組分其功能活性不同［6－8］，但酯型茶黃素由于結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，其在水中的溶解度比簡(jiǎn)單茶黃素相對(duì)較低。紅茶飲料，尤其是在以茶黃素為主要原料的功能飲料中，如果酯型茶黃素的比例過(guò)高，難溶于水的酯型茶黃素會(huì)通過(guò)分子間相互作用力聚集形成大量沉淀，不但影響產(chǎn)品外觀，而且降低了茶黃素被人體攝入的可能性，進(jìn)而影響茶黃素功效的有效發(fā)揮。為了獲得溶解性好的簡(jiǎn)單茶黃素，本試驗(yàn)將單寧酶、脂肪酶、豬胰脂肪酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、糖化酶、果膠酶和α－淀粉酶對(duì)酯型茶黃素的水解效果進(jìn)行比較，篩選最佳水解酶，并確定該酶水解酯型茶黃素的最佳反應(yīng)條件，最終使簡(jiǎn)單茶黃素的含量得到顯著提高，旨在探討茶黃素酶促水解的可能途徑，以期為TF單體的制備、功能飲料、天然化妝品、口服液等茶黃素類保健產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅茶提取物粉末（TF∶TF－3－G∶T－3’－G∶TFDG＝1∶2.37∶0.90∶3.49）：TFs質(zhì)量分?jǐn)?shù)為31%，長(zhǎng)沙飛拓植物制品有限公司；

黑曲霉單寧酶：200U/g，昆明杰輝物技術(shù)有限公司；

脂肪酶1：5 000U/g，日本 Meito公司；

脂肪酶2：5×105U/g，深圳綠微康生物工程有限公司；

豬胰脂肪酶：2.5×104U/g，上海伯奧生物科技有限公司；

木瓜蛋白酶：8×105U/g，上海生物化學(xué)試劑公司；

胰蛋白酶：2.5×105U/g，中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司；

果膠酶：5 000U/g，德國(guó)Serva公司；

α－淀粉酶：2 000U/g，德國(guó) Merck公司；

糖化酶：500U/g，無(wú)錫酶制劑廠；

乙腈、甲醇：色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑廠；

乙酸乙酯、冰醋酸、無(wú)水乙醇、Na2HPO4、NaH2PO4：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：LC－10ATVP，日本島津公司；

色譜數(shù)據(jù)工作站：LC solution，日本島津公司；

色譜柱：Ecosil C185μm×4.6mm×150mm，日本Lubex公司；

電子天平（0.0001）：4504MP，美國(guó) Mettler－Toledo公司；

超聲波清洗器：KQ3200B型，昆明市超聲儀器有限公司；

pH 計(jì)：DELTA－320，美國(guó) Mettler－Toledo公司；

搖床：SKY－200B，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茶黃素溶液的配制 準(zhǔn)確稱取TFs質(zhì)量分?jǐn)?shù)為31%的紅茶提取物粉末1.000 0g，溶于100mL乙醇中，超純水定容至1 000mL，配制成0.1%質(zhì)量濃度的溶液待用，此時(shí)TF濃度為52.51mg/g。

1.3.2 茶黃素液相色譜分析方法 色譜柱為Ecosil C185μm×4.6mm×150mm，流動(dòng)相 A為2%醋酸，流動(dòng)相B為乙腈－乙酸乙酯（體積比7∶1），梯度洗脫，流動(dòng)相B在30min內(nèi)從18%線性梯度變化到30%，流速0.9mL/min；柱溫40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280nm；進(jìn)樣量10μL。

1.3.3 酶解試驗(yàn)方法 以未加酶的0.1g/L茶黃素溶液作為對(duì)照，分別取適量α－淀粉酶、單寧酶、脂肪酶1、脂肪酶2、豬胰脂肪酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、糖化酶和果膠酶，加超純水定容至10mL，得到酶活力均為1 000U的酶溶液。將酶溶液轉(zhuǎn)移至具塞錐形瓶中，分別加入40mL 0.1g/L茶黃素溶液，用磷酸緩沖鹽將含單寧酶、果膠酶的溶液pH值調(diào)為4.5，其余溶液pH值調(diào)為7.0，使其pH值均處于酶活力pH值范圍內(nèi)，置于搖床中，于37℃、120r/min反應(yīng)24h，進(jìn)行高效液相色譜分析。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

（1）單寧酶添加量對(duì)單寧酶水解酯型茶黃素的影響：以0.1g/L茶黃素溶液為原料，調(diào)單寧酶濃度為0.2，0.6，1.0，1.4，1.6，2.0，2.4，3.0，4.0，6.0mg/mL，于37 ℃、120r/min搖床中反應(yīng)12h，高效液相色譜檢測(cè)茶黃素各組分的含量。

（2）反應(yīng)溫度對(duì)單寧酶水解酯型茶黃素的影響：以0.1g/L茶黃素溶液為原料，取酶濃度2.4mg/mL，在溫度分別為 20，25，30，35，40，45，50，55，60 ℃，和120r/min、pH 7.0條件下反應(yīng)12h，高效液相色譜檢測(cè)茶黃素各組分的含量。

（3）反應(yīng)時(shí)間對(duì)單寧酶水解酯型茶黃素的影響：以0.1g/L茶黃素為原料，單寧酶添加量為2.4mg/mL，溫度為40℃，120r/min，pH 7.0的條件下反應(yīng)，每隔30min取樣1次作高效液相色譜分析。

（4）pH值對(duì)單寧酶水解酯型茶黃素的影響：以0.1g/L茶黃素溶液為原料，單寧酶添加量2.4mg/mL，溫度為40℃，120r/min，pH 分 別為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0的條件下反應(yīng)2h，利用高效液相色譜檢測(cè)茶黃素各組分的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 水解酶對(duì)酯型茶黃素的水解效果

酶解后4種茶黃素的含量見表1。

表1 水解酶對(duì)酯型茶黃素的水解效果Table 1 Effect of different hydrolyticenzymes on estertheaflavins /（mg·g－1）

由表1可知，單寧酶能有效水解酯型茶黃素，其中TFDG的含量明顯降低，TF的含量明顯提高，其余酶的加入基本不影響4種茶黃素比例的變化，說(shuō)明它們對(duì)酯型茶黃素的降解效果不明顯，故以優(yōu)選出的單寧酶進(jìn)行下一步試驗(yàn)。從茶黃素的分子結(jié)構(gòu)看，酯型茶黃素的沒(méi)食子酰基暴露于吡喃環(huán)外側(cè)，較為活潑，易于被水解酶切除。α－淀粉酶、脂肪酶、豬胰脂肪酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、糖化酶和果膠酶均屬于水解酶類，且它們均能在酯的合成中起到催化作用，而酯的水解是酯的合成的逆反應(yīng)，故上述各酶在一定的條件下可能會(huì)起到水解酯的作用［9－10］。單寧酶對(duì)沒(méi)食子酸酯具有專一水解性，已廣泛應(yīng)用于酯型兒茶素的水解［11］。

2.2 單寧酶酶解酯型茶黃素最佳反應(yīng)條件的確定

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)上述因素作四因素三水平的正交分析，因素水平設(shè)置見表2，L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 正交因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 L9（34）試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 The table of orthogonal experiment of the L9（34）

由表3的極差分析可以看出，各因素對(duì)TF含量影響的順序是A＞C＞D＞B；酶解條件的最佳組合是A2B2C1D2，即pH值5、溫度40℃、反應(yīng)時(shí)間2h、酶濃度2.4mg/mL，該組合條件下所得產(chǎn)物TF質(zhì)量濃度為199.84mg/g，優(yōu)于單因素試驗(yàn)的結(jié)果和正交組合中試驗(yàn)號(hào)6的198.37mg/g的最高TF質(zhì)量濃度。方差分析的結(jié)果見表4。由表4可知，pH和反應(yīng)時(shí)間對(duì)單寧酶水解茶黃素的影響顯著。

表4 正交試驗(yàn)方差分析表Table 4 The table of variance analysis of orthogonal experiment

2.3 單寧酶處理前后茶黃素含量的對(duì)比

在40℃、pH＝5、酶濃度2.4mg/mL條件下，將0.1g/L的茶黃素溶液置于搖床中以120r/min反應(yīng)2h，單寧酶處理前后4種茶黃素含量的對(duì)比見表5。由表5可知，所得產(chǎn)品中TF的含量達(dá)199.84mg/g，較原有產(chǎn)品有很大的提高。3種酯型茶黃素 TF－3－G、TF－3’－G和 TFDG的水解較為徹底，TFDG被單寧酶切除兩個(gè)沒(méi)食子酰基，TF－3－G 和 TF－3’－G被單寧酶切除一個(gè)沒(méi)食子酰基，3種酯型茶黃素的水解后的終產(chǎn)物均為TF和沒(méi)食子酸。

表5 單寧酶處理前后4種茶黃素含量對(duì)比Table 5 The contrast of four theaflavins contents before and after the Tannase treatment /（mg·g－1）

3 結(jié)論

（1）單寧酶對(duì)酯型茶黃素的水解效果優(yōu)于其他水解酶，對(duì)單寧酶水解酯型茶黃素的反應(yīng)條件優(yōu)化后，3種酯型茶黃素已基本轉(zhuǎn)化為TF，利用單寧酶水解技術(shù)能夠得到TF含量高的茶黃素。相較于常規(guī)色譜分離法，整個(gè)處理過(guò)程只用到少量乙醇，沒(méi)有其他任何有害溶劑的介入，水解反應(yīng)時(shí)間只需2h，該項(xiàng)技術(shù)具有綠色、高效的特點(diǎn)，且TF在水中的溶解度比酯型茶黃素要高，拓寬了茶黃素在食品、化妝品，特別是功能性飲料領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

（2）單寧酶在水解酯型茶黃素的同時(shí)，也能水解茶黃素中殘存的酯型兒茶素，水解后的兒茶素更容易通過(guò)柱層析與茶黃素分離。在高TF含量的茶黃素基礎(chǔ)上，通過(guò)大孔樹脂去除混合物中的兒茶素、沒(méi)食子酸、咖啡堿、綠原酸等雜質(zhì)，可以純化制備TF單體，為TF單體的開發(fā)提供了一種簡(jiǎn)單高效的新思路。

（3）如何利用固定化單寧酶水解酯型茶黃素，從而降低TF的生產(chǎn)成本，以及TF在不同環(huán)境條件下的穩(wěn)定性試驗(yàn)，是該領(lǐng)域下一步的研究熱點(diǎn)。

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Optimization on hydrolysis condition of estertheaflavins by hydrolytic enzymes

CAI Shao－h(huán)ua LIU Zhong－h(huán)ua HUANG Jian－anWANG Kun－bo

（1.Key Lab of Tea Science of Ministry of Education，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan410128，China；2.National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients，Changsha，Hunan410128，China）

The research was designed by using enzymes including tannase，lipase，porcine pancreatic lipase，papain，trypsin，glucoamylase，pectinase andα－amylase，to compare the hydrolytic effect of estertheaflavins（TFDG）and to obtain the optimum reaction conditions of the best hydrolase was selected.Results showed that the optimum condition were as follows：temperature of reaction system 40℃，pH 5，enzyme concentration 2.4mg/mL，reaction time 120min.The content of TF increased from 52.51mg/g to 199.84mg/g under these optimum conditions.

theaflavins；hydrolase；tannase

10.3969/j.issn.1003－5788.2011.03.036

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30901161）；科技部國(guó)際合作重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：2006DFA33220）；國(guó)家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（編號(hào)：2010）

蔡少華（1986－），男，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。E－mail：ahua＿cai＠yahoo.com.cn

劉仲華

2011－03－01