湖南省香蔥RAPD遺傳多樣性分析

摘要：利用ＲＡＰＤ技術(shù)對(duì)１６份香蔥（Ａｌｌｉｕｍ ａｓｃａｌｏｎｉｃｕｍ）種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。從１００個(gè)隨機(jī)引物中篩選出１８?jìng)€(gè)具有多態(tài)性的引物，共擴(kuò)增出１５６條重復(fù)性好而且清晰的條帶，其中１１１條為多態(tài)性帶，占總條帶數(shù)的７０．９％。材料間遺傳相似系數(shù)變化范圍為０．２０７～０．９７５。在遺傳相似系數(shù)為０．７８的水平上，聚類分析可將１６份香蔥種質(zhì)資源分為６類。

關(guān)鍵詞：香蔥（Ａｌｌｉｕｍ ａｓｃａｌｏｎｉｃｕｍ）；ＲＡＰＤ；遺傳多樣性；聚類分析

中圖分類號(hào)：Ｓ６３３．１ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０11）23－4971-03

ＲＡＰＤ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｕｎａｎ Ｓｈａｌｌｏｔ

ＤＵ Ｙｕｎ－ａｎ，ＱＩＡＯ Ｎａｉ－ｎｉ，ＬＩＡＮＧ Ｊｉ－ｈｕａ，ＣＨＥＮ Ｙｉ－ｙｕａｎ，ＸＩＡＮＧ Ｇｕｏ－ｈｏｎｇ

（Ｃｈａｎｇｄｅ Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｃｈａｎｇｄｅ ４１５０００，Ｈｕｎａｎ，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＲＡＰＤ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ １６ ｓｈａｌｌｏｔ（Ａｌｌｉｕｍ ａｓｃａｌｏｎｉｃｕｍ） ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎ Ｈｕｎａｎ pｒｏｖｉｎｃｅ． １８ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｏｕｔ ｏｆ １００ ｒａｎｄｏｍ ＲＡＰＤ ｐｒｉｍｅｒｓ． １５６ ｃｌｅａｒ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ， ａｍｏｎｇ ｗｈｉｃｈ １１１ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｂａｎｄｓ， ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ ｔｏ ７０．９％ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｂａｎｄｓ． Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ０．２０７ to ０．９７５． Ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｄｉｖｉｄｅｄ ｔｈｅ ｔｅｓｔｅｄ 16 ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎｔｏ ６ ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｗａｓ ０．７８．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｓｈａｌｌｏｔ（Ａｌｌｉｕｍ ａｓｃａｌｏｎｉｃｕｍ）； ＲＡＰＤ； ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ； ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ

目前湖南省香蔥（Ａｌｌｉｕｍ ａｓｃａｌｏｎｉｃｕｍ Ｌ．）種質(zhì)資源較少，品質(zhì)低下，產(chǎn)量較低，對(duì)香蔥種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行初步鑒定，可為香蔥的進(jìn)一步引種、育種和種質(zhì)資源鑒定與保護(hù)提供參考［1］。本試驗(yàn)用ＲＡＰＤ技術(shù)對(duì)湖南省境內(nèi)香蔥種質(zhì)資源的遺傳關(guān)系進(jìn)行研究，以期為香蔥優(yōu)良品種的篩選工作提供一定的理論依據(jù)。

１ 材料與方法

１．１ 材料

于２００８年１１月至２００９年７月收集湖南省種植的１６份香蔥種質(zhì)資源，各種質(zhì)資源的名稱、采集時(shí)間、收集方法及采集地點(diǎn)見(jiàn)表１。

１．２ 方法

１．２．１ ＤＮＡ提取 參照Ｕｋｏｓｋｉｔ的方法［2］進(jìn)行香蔥ＤＮＡ的提取，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度。

１．２．２ ＲＡＰＤ反應(yīng) 選用北京賽百盛基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)的ｓＡ、ｓＢ、ｓＣ、ｓＤ、ｓＥ組共１００個(gè)１０聚體的寡核苷酸隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增篩選，從中選出擴(kuò)增條帶多且清晰的１８?jìng)€(gè)引物用于遺傳多樣性分析。ＲＡＰＤ反應(yīng)體系［3］為：１０×Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ，ｄＮＴＰｓ ４ μＬ，Ｍｇ２＋ ５ μＬ，引物ｐ１ １ μＬ，引物ｐ２ １ μＬ，Ｔａｑ酶０．２ μＬ，ＤＮＡ模板１ μＬ （濃度為２５～２８ ｎｇ／μＬ），加滅菌蒸餾水至５０ μＬ。反應(yīng)程序?yàn)椋海梗?℃預(yù)變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性５０ ｓ，３６ ℃退火３０ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，４５個(gè)循環(huán)；７２ ℃延伸７ ｍｉｎ［4］。產(chǎn)物用１．５％瓊脂糖凝膠電泳２ ｈ，ＥＢ染色檢測(cè)，拍照。每對(duì)引物在１６份種質(zhì)資源中重復(fù)擴(kuò)增３次。

１．２．３ 遺傳多樣性分析［5］ 將觀察到的每一條清晰的條帶視為一個(gè)形態(tài)形狀，有條帶時(shí)記為“１”，無(wú)條帶時(shí)記為“０”，形成０／１矩陣輸入計(jì)算機(jī)。利用ＮＴＳＹＳｐｃ（２．１０）軟件進(jìn)行分析，采用Ｄｉｃｅ相似系數(shù)，用ＵＰＧＭＡ（Ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ Ｐａｉｒ ｇｒｏｕｐ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ ａｖｅｒａｇｅｓ）法進(jìn)行聚類，并運(yùn)用軟件ＳＰＳＳ １３．０計(jì)算出種質(zhì)資源之間的遺傳相似系數(shù)矩陣。

２ 結(jié)果與分析

２．１ 擴(kuò)增結(jié)果

用篩選出的１８?jìng)€(gè)１０ ｂｐ的隨機(jī)引物對(duì)１６份材料進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示每個(gè)引物擴(kuò)增出的條帶從５條到１３條不等，選用的１８?jìng)€(gè)引物共擴(kuò)增出１５６條重復(fù)性好、譜帶清晰的條帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出8．67條，其中１１１條為多態(tài)性條帶，占總條帶數(shù)的７０．９％，表現(xiàn)出良好的遺傳多樣性，擴(kuò)增出的多態(tài)性帶大小主要分布在２００～１ ５００ ｂｐ范圍內(nèi)，其中引物ｓ１５９、ｓ３３１擴(kuò)增出的多態(tài)性帶率最高（表２），可在一定程度上將１６份材料區(qū)分開(kāi)來(lái)。所有種質(zhì)資源的主擴(kuò)增帶都一致，表明其同源性較高（圖１－３）；同時(shí)有個(gè)別材料有特異性條帶或特異性缺失條帶，可以作為種質(zhì)鑒定的參考依據(jù)。

２．２ 香蔥種質(zhì)資源的聚類分析

根據(jù)１８?jìng)€(gè)隨機(jī)引物的擴(kuò)增結(jié)果，運(yùn)用軟件ＳＰＳＳ １３．０計(jì)算１６份香蔥種質(zhì)資源之間的遺傳相似系數(shù)矩陣［6］（表３），然后用ＮＴＳＹＳ ｐｃ ２．１軟件，采用ＵＰＧＭＡ聚類方法對(duì)其進(jìn)行聚類分析［7，8］，構(gòu)建出分子系統(tǒng)樹(shù)狀圖（圖４）。可以看出，在０．６４處劃一直線，可以將１６份香蔥種質(zhì)資源分為兩類，山東抗蔥與武陵源香蔥為第Ⅰ大類，其余材料為第Ⅱ大類；再?gòu)模埃罚柑巹澮恢本€，１６份材料被分為６類，其中山東抗蔥與武陵源香蔥各聚為一類，第Ⅱ大類可進(jìn)一步分為四個(gè)亞類，亞類ⅰ為安鄉(xiāng)香蔥、石門香蔥、臨澧香蔥等９個(gè)品種，亞類ⅱ為津市香蔥、洪江香蔥，亞類ⅲ為冷水江香蔥、新化香蔥，亞類ⅳ為雙峰香蔥。山東抗蔥和武陵源香蔥與其他類的遺傳距離較遠(yuǎn)，同時(shí)所有地方品種并未完全按照原產(chǎn)地區(qū)而聚類，這可能是由于多年來(lái)各材料間相互雜交，從而使種質(zhì)資源間關(guān)系復(fù)雜化所造成的。

３ 結(jié)論

香蔥的栽培歷史悠久，品種繁多，運(yùn)用分子標(biāo)記等技術(shù)分析各種質(zhì)資源間復(fù)雜的遺傳關(guān)系，成為亟待解決的問(wèn)題。另外，在實(shí)際雜交選育過(guò)程中，應(yīng)積極從國(guó)內(nèi)外引進(jìn)一些抗性強(qiáng)、產(chǎn)量高的優(yōu)良品種，并根據(jù)聚類分析結(jié)果，選擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的材料，從而選育出變異豐富、性狀好、產(chǎn)量高，更能適應(yīng)我國(guó)氣候特點(diǎn)的香蔥新品種。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 劉良科，歐立軍，蔣向輝，等． 基于RAPD標(biāo)記分析蔥屬7個(gè)栽培品種的遣傳多樣性［Ｊ］． 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００9，37（35）：17382-17385．

［2］ ＵＫＯＳＫＩＴ Ｋ， ＴＨＯＭＰＳＯＮ Ｐ Ｇ， ＷＡＴＳＯＮ ＪＲ Ｃ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ａ ｒａｎｄｏｍｌｙ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ （ＲＡＰＤ） ｍａｒｋｅｒ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ａ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｒｏｏｔ－ｋｎｏｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏ［Ｊ］． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９７， １２２（６）：８１８－８２１．

［3］ 陳沁濱，侯喜林，陳曉峰，等． 洋蔥種質(zhì)資源的ＲＡＰＤ分析［Ｊ］． 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），２００７，２８（１）：８８－９１．

［4］ DENG L Q，ZHANG K，HUANG K F，et al． RAPD analysis for genetic diversity of nineteen common and tartary buckwheat varieties［Ｊ］． Agricultural Science Technology，２０11，12（１）：65－69．

［5］ 崔成日，徐啟江，崔崇士，等． 洋蔥ＲＡＰＤ遺傳多樣性分析［Ｊ］． 園藝學(xué)報(bào)，２００６，３３（４）：８６３－８６５．

［6］ 盧龍斗，熊 蕾． 蔥屬１２種植物的ＲＡＰＤ分析［Ｊ］． 西北植物學(xué)報(bào)，２００２，２２（５）：１０８６－１０９２．

［7］ 陳沁濱，侯喜林，王建軍，等． 洋蔥（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ Ｌ．）ＲＡＰＤ－ＰＣＲ反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序的優(yōu)化［Ｊ］． 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，２００６，２２（４）：４３４－４３８．

［8］ 陳沁濱，侯喜林，陳曉峰，等． 洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因ＲＡＰＤ及ＳＣＡＲ分子標(biāo)記研究［Ｊ］． 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，２００７，３０（４）：１６－１９．