三七不同部位總皂苷溶血性及體外免疫活性研究

摘要：通過常規正丁醇法提取，大孔樹脂層析分離純化得三七（Ｐａｎａｘ ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ）總皂苷；通過溶血試驗測定紅細胞溶血率；脾淋巴細胞增殖試驗測定三七不同部位總皂苷的生物免疫活性。結果表明，三七不同部位總皂苷溶血性較小，且均能顯著促進ＣｏｎＡ和ＬＰＳ誘導小鼠淋巴細胞增殖反應，其免疫增強作用以三七主根總皂苷的效果較好。表明三七不同部位總皂苷安全性好，能促進細胞免疫和體液免疫。

關鍵詞：三七（Ｐａｎａｘ ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ）總皂苷；生物免疫活性；溶血性；脾淋巴細胞增殖反應

中圖分類號：Ｒ３９２ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）23－4905-03

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｐａｒｔｓ ｏｆ

Ｐａｎａｘ ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ

LIANG Yong，QIN Feng，TANG Xiao-lei

（Jiangsu Vacational and Technical College of Husbandry and Veterinary， Taizhou 225300， Jiangsu，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｐａｎａｘ ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ ｓａｐｏｎｉｏｎｓ（ＰＮＳ） was purified by cｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｂｕｔａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ and ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｒｅｓｉｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Eｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ rate was determined by hemdytic test， ＰＮＳ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｍｍｕｎｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ from different parts of P. notoginseng was measured by spleen lymphocyte proliferation test． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐａｒｔｓ ｏｆ Ｐ. ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ were ｓｍａｌｌｅｒ， ａｎｄ ｃould ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ by ConA and LPS， and ｉｍｍｕｎｅ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｔｏ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｏｆ Ｐ. ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ ｒｏｏｔ waｓ ｂｅｔｔｅｒ． Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ the security of PNS from ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐａｒｔｓ ｏｆ Ｐａｎａｘ ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ ｗａｓ ｇｏｏｄ， ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐａｎａｘ ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ ｓａｐｏｎｉｏｎｓ（ＰＮＳ）； ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ； ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ； ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ

中藥三七來源于五加科植物三七（Ｐａｎａｘ ｎｏｔｏｇｉｎｓｎｇ（Ｂｕｒｋ）Ｆ．Ｈ．Ｃｈｅｎ），主產于我國廣西云安，為我國特產的傳統珍貴中藥材。三七主根習稱“頭子”，支根習稱“筋條”。三七總皂苷（PNS）是三七的主要生理活性成分，具有擴張血管、降低心肌耗氧量、延長凝血時間、調節免疫等藥理作用。三七總皂苷在高等動物的消化道中不能被吸收，故口服無溶血毒性，但其注射劑應用于臨床有很小的溶血性，故研究皂苷的溶血性對臨床用藥安全性評價有很大的作用。目前三七總皂苷在免疫領域的研究較少，三七不同部位（主根、支根）總皂苷的免疫活性研究基本上還是空白［1］。本試驗通過探討不同部位總皂苷的溶血性和體外免疫活性，為ＰＮＳ提取工藝的優化、分離純化及臨床合理用藥等提供一定的參考。

１ 材料與方法

１．１ 材料與儀器

三七藥材、三七筋條藥材（云南產），均購于泰州醫藥公司；ＴＵ－１８００紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；ＢＰ２１１Ｄ電子天平（北京賽多利斯公司）；ＲＥ－３０００旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；ＳＨＺ－Ⅲ型循環水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；ＴＧＬ－１６Ｇ型高速離心機（江蘇金壇中大儀器廠）；黃芪多糖（ＨＱ）：本實驗室制備，含量大于６０％；Ｄ１０１大孔吸附樹脂（泰州恒泰器化玻有限公司）；ＲＰＭＩ １６４０細胞培養液（美國ＧＩＢＣＯ公司產品）；全自動酶標儀（上海安泰分析儀器有限公司）。其他試劑均為分析純。普通級新西蘭兔，１８～２２ ｇ重的 ＩＣＲ小鼠，均購自揚州大學畜牧醫學院動物實驗中心。

１．２ 方法

１．２．１ 總皂苷的提取、分離［２］ 稱取藥材三七筋條粗粉，以體積分數７０％的乙醇回流提取３次，每次２ ｈ，過濾，合并濾液，減壓回收乙醇，浸膏加適量水混懸，用正丁醇萃取至正丁醇液近無色，合并萃取液，減壓回收正丁醇，得粗制三七筋條總皂苷。粗制皂苷用蒸餾水溶解，經Ｄ１０１大孔吸附樹脂柱色譜除去糖類水溶性雜質，然后以體積分數９５％的乙醇洗脫，合并洗脫液，減壓回收乙醇，并濃縮至干，得精制三七筋條總皂苷（ＪＴ）。三七主根總皂苷（ＺＧ）的制備工藝同上。

取上述２種皂苷適量，以生理鹽水溶解制成質量濃度為４ ｍｇ／ｍＬ的溶液，并以０．２２ μｍ微孔濾膜濾過除菌，備用。

１．２．２ 紅細胞懸浮液的制備［3］ 取新西蘭兔１只，心臟取血１５ ｍＬ，置于盛有玻璃珠的三角瓶中，輕輕振搖１５ ｍｉｎ， 去除纖維蛋白。將去纖維蛋白血加入１０倍量血球稀釋液， 混勻后以２ ５００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ，棄上清液，再加入血球稀釋液離心，反復３ 次，至上清液呈無色透明液體，以血球稀釋液稀釋制備體積分數為２％ 的紅細胞懸液備用。

１．２．３ 供試品溶液的制備 精密稱取６０ ℃下干燥至恒重的ZG及ＪＴ粉末，用生理鹽水定容至５０ ｍＬ容量瓶中，作為供試品溶液。

１．３ 溶血率測定［4］

取供試品溶液，用０．４５ μｍ微孔濾膜過濾后，分別用生理鹽水稀釋，制成濃度為０．００４～８．192 ｍｇ／ｍＬ （成倍比遞增）共１２個濃度系列，每種樣品各８個濃度梯度，并設４次重復。各取２ ｍＬ不同濃度供試品溶液，分別加２ ｍＬ ２％紅細胞懸浮液于試管中，并以生理鹽水和蒸餾水分別做最大和最小溶血對照。將上述各試管置３７ ℃恒溫水浴鍋培養1 ｈ后，離心，取上清，在４１２ ｎｍ處測定吸光度，記錄結果。

溶血率按下式計算：

溶血率＝（Aｉ－A０）／（Aｍａｘ－A０）×１００％

式中，Aｍａｘ為陽性對照蒸餾水作用組的吸光度；A０為生理鹽水作用組吸光度；Aｉ為不同濃度的皂苷作用時測得的吸光度。

１．4 體外小鼠脾淋巴細胞增殖試驗［５］

１．4．１ 脾細胞懸液制備 無菌條件下取小鼠的脾臟，加適量Ｈａｎｋｓ液研磨，以２００目不銹鋼網過濾，１ ５００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ，棄上清液，加Ｈａｎｋｓ液重復洗滌２次。收集脾細胞，加適量ＲＰＭＩ１６４０培養液稀釋。

１．4．２ 淋巴細胞增殖反應 于９６孔微量板中，每孔加１００ μＬ脾細胞懸液和５０ μＬ濃度為４００．００、４０．００、０．４０、０．０４ μｇ／ｍＬ皂苷稀釋液，每個濃度重復１２孔，并分別加ＣｏｎＡ液（終濃度為５ μＬ／ ｍＬ）、ＬＰＳ液（終濃度為１０ μＬ／ ｍＬ）或ＲＰＭＩ１６４０培養液至終體積為２００ μL。另設正常對照組及空白對照組。３７ ℃、５％ ＣＯ２培養４４ ｈ后，各孔加入５０ μＬ ＭＴＴ溶液（２ ｍｇ／ｍＬ），繼續培養４ ｈ。１ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ，棄去各孔上清，分別加入１５０ μＬ酸性ＤＭＳＯ溶液，振蕩，于室溫暗處放置１５ ｍｉｎ，以酶標儀于波長５７８ ｎｍ處測定吸光度，并按下式計算刺激指數（ＳＩ）： ＳＩ＝加有絲分裂原培養物的吸光度值／不加有絲分裂原培養物的吸光度值。

２ 結果與分析

２．１ 溶血性試驗結果

三七主根和筋條皂苷分別以ＺＧ、ＪＴ表示。實驗數據用ｘ±ｓｅ表示，并用ｔ檢驗法比較各組間的統計學差異。

從表１可以看出，三七不同部位皂苷的溶血性遠遠小于三萜總皂苷（ＱｕｉｌＡ）的溶血率［（１９．９１±０．５７）ｍｇ／ｍＬ［6］，表明三七皂苷的安全性較好；并且不同部位提取物的溶血率不同，與ＪＴ相比，ＺＧ的溶血作用更小。

２．２ 免疫活性試驗結果

由圖１、２、３可以看出，三七不同部位總皂苷呈劑量依賴性地促進ＣｏｎＡ和ＬＰＳ兩種刺激誘導的小鼠Ｔ、Ｂ淋巴細胞增殖能力。Ｔ淋巴細胞主要完成細胞免疫，Ｂ淋巴細胞是體內惟一能產生抗體的細胞，通過不同的抗體來發揮其體液免疫的功能［7］。ＺＧ體外能促進細胞免疫，在一定程度上也能促進體液免疫，ＪＴ體外能促進體液免疫，對細胞免疫的效果不顯著。

３ 討論

皂苷是在植物界中廣泛存在的一類生物活性成分，其對體液免疫及細胞免疫的調節作用已在狗、牛、羊、鼠及靈長類動物模型上得到證實。研究證實，溶血性與分子結構有很大的關系，有無溶血作用與皂甙元有關，作用強弱與糖分子的大小、糖之間的鏈接、糖分子上的取代基等有關，并不是所有的皂苷都有溶血性，并且三萜皂苷的溶血性小于甾體皂苷［6］。ＱｕｉｌＡ系從南美皂樹（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）中分離得到的三萜總皂苷，具有較好的免疫活性，廣泛應用于動物臨床。ＱｕｉｌＡ皂苷成分盡管為三萜皂苷，但溶血性仍然很大，其ＨＤ５０顯著高于三七不同部位總皂苷的溶血性，表明三七皂苷的安全性較好。

試驗結果說明三七筋條總皂苷雖有一定的免疫增強作用，但其效果較主根總皂苷的效果差。因此，其進一步的開發利用尚需結合現代提取分離技術，繼續分離純化，尋找其有效部位。體外試驗具有受外界環境因素的影響比較小，能客觀反映試驗結果的優點，但缺乏中藥成分的體內作用過程。因此，三七不同部位總皂苷體內免疫作用機制等尚需進一步研究。

參考文獻：

［1］ 張劍峰，張丹參．三七總皂苷藥理作用研究進展［Ｊ］．醫學綜述，２００７，１３（６）：４７２－４７４．

［２］ 潘俊杰，鄭 琴，楊 明． 三七中三七總皂苷的提取、分離純化及分析方法的研究進展［Ｊ］．世界科學技術——中醫藥現代化，２００７，９（６）：７７－８２．

［3］ 秦 楓，陳玉勇． 三七皂苷ＰＮＳ－５的溶血性及生物免疫活性研究［Ｊ］．中國醫藥導報，２００８，５（２９）：１０－１１．

［4］ 陳金月，秦耀輝，李海英．血塞通注射液體外溶血反應研究［Ｊ］．藥物不良反應雜志， ２００６，８（６）：４１４－４１７．

［５］ 岳 麗，王 輝， 黃雪松， 等． 大蒜多糖Ｂ對免疫小鼠活性調節［Ｊ］．暨南大學學報（醫學版），２００９，３０（６）：６０１－６０５．

［6］ 秦 楓，陳玉勇，孫紅祥，等． 三七總皂苷的溶血性及體外生物免疫活性研究［Ｊ］．中國獸藥雜志，２００８，４２（６）：２６－２８．

［7］ 彭書玲，郭兆安．三七總皂苷的作用機制研究進展［Ｊ］．中國中西醫結合急救雜志，２００８，１５（１）：６３－６４．