豬鸚鵡熱衣原體CJ4株生物學特性研究

摘要：從發病豬分離出鸚鵡熱衣原體（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）ＣＪ４株，該菌株對青霉素敏感，不被磺胺嘧啶鈉所抑制；能夠致死６～７日齡雞胚，其ＥＬＤ５０為１０-７．69/０．３ ｍＬ；用該毒株制備的疫苗免疫小鼠可以抵抗衣原體強毒的攻擊，具有較好的免疫原性。

關鍵詞：豬衣原體（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）ＣＪ４株；生物學特性；免疫原性

中圖分類號：Ｓ８５２．６７；Ｓ８５８．２８ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）23－4902-03

Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ＣＪ４ Ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｓｗｉｎｅ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ

ＬＩＵ Ｚｅ－ｗｅｎ，ＴＩＡＮ Ｙｏｎｇ－ｘｉａｎｇ，ＺＨＯＵ Ｄａｎ－ｎａ，ＹＵＡＮ Ｆａｎｇ－ｙａｎ，ＹＡＮＧ Ｋｅ－ｌｉ，ＬＩＡＮＧ Ｗａｎｇ－ｗａｎｇ，

ＤＵＡＮ Ｚｈｅｎｇ－ｙｉｎｇ，ＧＵＯ Ｒｕｉ

（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｗｕｈａｎ 430064， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ ＣＪ４ ｓｔａｉｎ was ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｉｌｌ ｓｗｉｎｅ． Ｉｔ ｗａｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ ｔｈｅ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ａｎｄ ｗａｓ ｕｎｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｕｌｆａｄｉａｚｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ． Ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｋｉｌｌ ｔｈｅ ｃｈｉｃｋ ｅｍｂｒｙｏ ｏｆ ６~７ ｄａｙｓ ａｇｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｔｉｔｅｒ ＥＬＤ５０ ｗａｓ １０-７．69／０．３ ｍＬ． Ｔｈｅ ｍｉｃｅ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｍａｄｅ ｏｆ ＣＪ４ ｓｔｒａｉｎ ｃｏｕｌｄ ｒｅｓｉｓｔ ｔｈｅ ａｔｔａｃｋ ｆｒｏｍ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｉｔ ｈａｄ ｗｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄs： sｗｉｎｅ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ； ＣＪ４ sｔｒａｉｎ； bｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ； ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ

衣原體病是由衣原體科衣原體屬鸚鵡熱衣原體（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）所引起的人畜共患傳染病，能使多種動物、禽類和人發病［１］。豬衣原體病是由鸚鵡熱衣原體引起的繁殖障礙等多種疾病的總稱，各年齡段的豬均能感染，但臨床表現有所不同。妊娠母豬主要表現為流產、死胎、產弱仔和圍產期新生仔豬大批死亡；公豬發生睪丸炎、附睪炎、尿道炎；斷奶仔豬常會發生肺炎、腸炎、多發性關節炎等，病死率較高。該病常給養豬生產帶來重大的經濟損失。

目前對豬衣原體病的早期感染可用四環素、土霉素、金霉素等多種抗生素治療，但由于其細胞內寄生性引起的隱性、持續性的感染以及長期使用抗生素所造成的耐藥性增加等因素，使得使用抗生素并不能從根本上控制該病。因而最有效的防治措施就是接種安全、有效的疫苗。

豬鸚鵡熱衣原體ＣＪ４株是從發病豬體內分離出來的具有良好免疫原性的菌株，對其生物學特性進行了研究，現報道如下。

１ 材料與方法

１．１ 試驗材料

豬鸚鵡熱衣原體ＣＪ４菌株由本實驗室分離、鑒定和保存；ＳＰＦ雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司，本實驗室恒溫箱培養６～７日齡時用于試驗；試驗用昆明小鼠購自湖北省醫學科學院實驗動物中心，飼養于湖北精牧獸醫技術開發有限公司試驗動物房。

１．２ 試驗方法

１．２．１ 培養特性 以雞胚卵黃囊膜懸液（1 g雞胚卵黃膜加100 mL PBS，下同）接種８～１０ ｇ小鼠，腹腔注射０．５ ｍＬ／只，４～５ ｄ后取小鼠脾臟和腹液涂片，用姬姆薩氏法染色，顯微鏡下觀察。

１．２．２ 藥物敏感性試驗

青霉素敏感性試驗：用雞胚卵黃囊膜研磨液進行試驗。將雞胚卵黃囊膜研磨液用滅菌的0.9%的生理鹽水作１０－１、１０－２、１０－３、１０－４、１０－５、１０－６、１０－７稀釋，分成２份，一份于每毫升雞胚卵黃囊膜研磨液中分別加青霉素２ ５００ Ｕ，在４ ℃下作用４ ｈ，分別在卵黃囊內接種６～７日齡雞胚５枚，每胚接種０．３ ｍＬ；另一份不添加青霉素，各?。埃?ｍＬ于卵黃囊內接種６～７日齡雞胚５枚作為對照。

磺胺嘧啶鈉敏感性試驗：用雞胚卵黃囊膜研磨液進行試驗。將雞胚卵黃囊膜研磨液用滅菌的0.9%的生理鹽水作１０－１、１０－２、１０－３、１０－４、１０－５、１０－６、１０－７稀釋，分成２份，一份于每毫升雞胚卵黃液中分別加入磺胺嘧啶鈉１０．０、７．５、５．０和１．０ ｍｇ，在４ ℃下作用４ ｈ，分別于卵黃囊內接種６～７日齡雞胚５枚，每胚接種０．３ ｍＬ；另一份不添加磺胺嘧啶鈉，各?。埃?ｍＬ于卵黃囊內接種６～７日齡雞胚５枚作為對照。

１．２．３ 毒力試驗 以雞胚卵黃囊膜懸液于卵黃囊內分別接種１００枚６～７日齡雞胚（0.3 mL/胚），接種后于３７ ℃條件下繼續孵化，記錄雞胚的死亡情況。

１．２．４ 毒價測定 將雞胚卵黃囊膜懸液用滅菌的０．９％的生理鹽水作１０倍系列稀釋，取１０－５、１０－６、１０－７、１０－８、１０－９稀釋液各接種6~7日齡雞胚４枚，接種劑量為0．３ ｍＬ，置３７ ℃孵育，記錄７２ ｈ后死亡雞胚數，并計算其雞胚半數致死量ＥＬＤ５０。

１．２．５ 免疫原性試驗 用ＣＪ４菌株接種雞胚卵黃囊，收集檢驗合格的雞胚卵黃囊膜，研磨、滅活后制成油乳劑滅活疫苗，皮下注射１８～２０ ｇ小鼠５只，每只０．３ ｍＬ；另設５只小鼠為對照，不注射疫苗。２１ ｄ后，試驗組和對照組小鼠全部腹腔注射衣原體強毒ＣＰＤ１３株卵黃囊培養物０．３ ｍＬ；８～１０ ｄ后，將免疫小鼠和對照小鼠全部剖殺，取肝、脾、腹液涂片，用姬姆薩氏染色，顯微鏡觀察。

２ 結果與分析

２．１ 菌株培養特性

感染小白鼠脾臟和腹液涂片，用姬姆薩氏法染色，１ ０００倍鏡檢，菌體呈紫紅色或寶石紅色，直徑大約０．１～０．６ μｍ，并可觀察到紅色的胞漿內包涵體。

２．２ 藥物敏感性試驗結果

２．２．１ 青霉素敏感性試驗結果 由表１可見，ＣＪ４菌株的卵黃囊膜研磨液對青霉素均敏感，菌株毒力被青霉素所抑制，試驗組雞胚全部存活。對照組雞胚全部死亡。

２．２．２ 磺胺嘧啶鈉敏感性試驗結果 由表２可見，ＣＪ４菌株對磺胺嘧啶鈉不敏感，菌株毒力不被磺胺嘧啶鈉所抑制，試驗組及對照組雞胚均全部死亡。

２．３ 菌株毒力試驗結果

由表３可見，以１∶１００雞胚卵黃囊膜懸液０．３ ｍＬ于卵黃囊內接種6~7日齡雞胚后，雞胚從第四天（接種后７２ ｈ內死亡雞胚不計）開始出現規律性死亡，第六天達到死亡高峰，主要死亡時間集中在第四至第八天，雞胚表面有典型的出血性病變。

２．４ 毒價測定結果

雞胚卵黃囊膜懸液不同稀釋液接種雞胚７２ ｈ后出現死亡，對照組雞胚全部成活（表４），根據Ｒｅｅｄ和Ｍｕｅｎｅｈ法計算ＥＬＤ５０，結果顯示，雞胚卵黃膜懸液接種６～７日齡其ＥＬＤ５０為１０-７．69/０．３ ｍＬ。

２．５ 免疫原性試驗結果

由表５可見，用ＣＪ４菌株制備疫苗免疫小白鼠后用衣原體強毒ＣＰＤ１３株攻擊，免疫小鼠均未檢出衣原體，而從對照小鼠的肝、脾和腹水中全部檢測到衣原體。

３ 小結與討論

１）鸚鵡熱衣原體是一種重要的人畜共患病病原，可引起多種動物和人患病，家畜中以豬、羊、牛較為易感。衣原體是介于細菌和病毒之間的一類微生物，含有ＤＮＡ和ＲＮＡ，以二分裂方式增殖，在細胞胞質內可形成包涵體，易被堿性染料著染。用姬姆薩氏染色，包涵體中原生小體呈紅色或紫紅色。衣原體對四環素類抗生素敏感，對慶大霉素、鏈霉素及磺胺嘧啶鈉等不敏感。目前已經研制出多種減毒活疫苗及滅活疫苗用于預防性接種，這些疫苗在一定程度上對該病的控制起到了積極的作用。但由于衣原體生物學特性和免疫學機制的復雜性，如何選擇免疫原性好的毒株研制高效疫苗，誘導機體特異性免疫力的產生具有非常重要的意義［２，３］。

２）藥物敏感性試驗表明，分離的衣原體ＣＪ４菌株對青霉素敏感，而對磺胺嘧啶鈉不敏感，證實其屬于鸚鵡熱衣原體屬。鸚鵡熱衣原體是引起母豬繁殖障礙的重要病原之一。近年來，許多研究人員和獸醫臨床工作者已陸續發現衣原體引起母豬的繁殖障礙、流產、死產、胎兒死亡、弱仔和傳染性不育，仔豬肺炎、腸炎、多發性關節炎、結膜炎以及公豬尿路感染、睪丸炎等多種疾病，造成豬群生產性能低下，殘次率增加和從能繁母豬獲得的健康仔豬不足，以致給養豬業帶來嚴重的經濟虧損［４］。

３）ＣＪ４菌株可以致６～７日齡雞胚全部死亡，證明該菌株具有很強的毒力，用該菌株制備的油乳劑滅活疫苗免疫小鼠后，可以抵抗衣原體強毒的攻擊，證實該菌株具有良好的免疫原性，是否可以作為疫苗株進行臨床應用，還有待進一步研究。

參考文獻：

［１］ 斯特勞 Ｂ Ｅ．豬病學［Ｍ］．趙德明，張中秋，沈建忠，譯．北京：中國農業出版社，２０００．

［２］ 高廣仁，段志勤，潘春容，等．豬鸚鵡熱衣原體流產滅活疫苗試生產試驗［Ｊ］．中國獸藥雜志，２００９，４３（１２）：１０－１３．

［３］ 張浩杰．衣原體疫苗研究進展［Ｊ］． 微生物學免疫學進展，２００１， ２９（２）：８３－８５．

［４］ 劉振江，羅啟慧．動物衣原體病研究現狀［Ｊ］．動物醫學進展，２００５，２５（２）：２９－３１．