生香酵母發酵無花果制備特色煙用香料的研究

摘要：利用生香酵母發酵無花果（Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ）開發特色天然煙用香料，采用ＧＣ／ＭＳ技術分析了該特色香料中的揮發性和半揮發性成分，采用熱裂解／氣相色譜／質譜聯用（ＰＹ／ＧＣ／ＭＳ）方法對其熱裂解產物進行分析，并進行了卷煙加料試驗。結果表明，①發酵無花果香料在卷煙中具有增加香氣量、增加煙氣甜潤感、降低刺激和改善余味的作用；②發酵無花果香料中共鑒定出４１種成分，主要有９，１２－十八碳二烯酸乙酯、十六酸乙酯、９，１２，１５－十八碳三烯酸乙酯、十七酸乙酯、９，１２－十八碳二烯酸甲酯、十六酸等化合物。③發酵無花果香料熱裂解后產生大量醛類、酮類和呋喃類物質，這些物質是構成卷煙香味的重要成分，能有效改善卷煙吸味。

關鍵詞：發酵；無花果（Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ）；熱裂解；氣相色譜／質譜；卷煙加料

中圖分類號：ＴＳ２６４．３ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）23－4923-04

Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｆｌａｖｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｆｉｃｕｓ cａｒｉｃａ ｂｙ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ

ＣＨＥＮ Ｙｉ１，ＰＡＮ Ｔｉｎｇ－ｔｉｎｇ１，２，ＲＯＮＧ Ｌｉｎ１，２，ＷＵ Ｚｈａｏ２，ＳＨＡＯ Ｘｉｎｇ－ｗｅｉ２，ＨＵＡＮＧ Ｌｏｎｇ１，２

（１． Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｃｈｉｎａ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｈｕｂｅｉ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｗｕｈａｎ ４３００４０， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｗｕｈａｎ Ｈｕａｎｇｈｅｌｏｕ Ｆｌａｖｏｒｓ ＆ Ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， Ｗｕｈａｎ ４３００４０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ ｗａｓ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ ｎｅｗ ｎａｔｕｒａｌ ｃｉｇａｒｅｔｔｅ ｆｌａｖｏｒ． Ｔｈｅ ｆｌａｖｏｒ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＧＣ／ＭＳ， ｐｙｒｏｌｙｓｅｄ ｂｙ ＰＹ／ＧＣ／ＭＳ ａｎｄ ａｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ｃｉｇａｒｅｔｔｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｌａｖｏｒ ｃｏｕｌｄ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｏｂａｃｃｏ ａｒｏｍａ ａｎｄ ｓｗｅｅｔ ｔａｓｔｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ， ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｏｆｆｅｎｓｉｖｅ ｏｄｏｒ ｏｆ ｃｉｇａｒｅｔｔｅ ｓｍｏｋｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ． ４１ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｌａｖｏｒ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ＧＣ／ＭＳ， ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔs and so on were ｏｆ ９，１２－ｏｃｔａ－ｄｅｃａｄｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ， ethyl palmitate， heptadecanoic acid ethyl ester， 9，12-octa-decadienoic acid methyl ester， ９，１２，１５－ｏｃｔａ－ｄｅｃａｔｒｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ and so on were ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｈｉｇｈ respectively． Ｔｈｅ ｐｙｒｏｌｙｓａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｌａｖｏｒ ｗｅｒｅ ｋｅｔｏｎｅｓ， ａｌｄｅｈｙｄｅｓ ａｎｄ ｆｕｎａｎｓ， ｗｈｉｃｈ ｐｌａｙｅｄ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｆｌａｖｏｒ ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ａｒｏｍａ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ； Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ； ｐｙｒｏｌｙｓｉｓ； ＧＣ／ＭＳ； ｃｉｇａｒｅｔｔｅ ｆｌａｖｏｒｉｎｇ

無花果（Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ Ｌ．）為桑科榕屬無花果亞屬植物，其果實含有豐富的葡萄糖、果糖、氨基酸、維生素、礦質元素、蛋白分解酶等，具有較高的營養價值和藥用價值，可以藥食兩用，能“健胃清腸、消腫解毒，治腸炎、痢疾、便秘、痔瘡、癰瘡、疥癬”［１］，并具有一定的抗腫瘤功效［２］。無花果也是一種天然香料，被廣泛用于食品、保健品、化妝品、煙草等行業［３－１０］，其在卷煙中的應用主要采用溶劑提取得到提取物或超臨界ＣＯ２萃取得到揮發油［１１－１３］，但采用生物技術制備煙用香料還未見報道。為開發新的天然煙用香料資源，采用生香酵母發酵無花果制備特色天然煙用香料，用ＧＣ／ＭＳ技術分析了該特色香料中的揮發性和半揮發性成分，采用熱裂解／氣相色譜／質譜聯用（ＰＹ／ＧＣ／ＭＳ）方法對無花果提取物的熱裂解產物進行分析，并進行了卷煙加料試驗。

１ 材料與方法

１．１ 材料

１．１．１ 材料 無花果購自武漢市藥材公司，產地新疆。

１．１．２ 儀器與試劑 ＴＲＡＣＥ ＧＣ Ｕｌｔｒａ－ＤＳＱⅡ氣相色譜／質譜聯用儀，配有自動進樣器（美國Ｔｈｅｒｍｏ公司）；ＰＹＲＯＰＲＯＢＥ ２０００（ＣＤＳ，美國）；ＢＰ２２１Ｓ型分析天平，感量０．１ ｍｇ，（德國Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公司）；數顯電熱恒溫干燥箱、喉頭噴霧器（武漢鼎立烘箱爐業有限公司）；旋轉蒸發器ＲＥ－５ＩＡＡ（上海亞榮生化儀器廠）；ＳＨＺ－Ｄ循環式真空泵、電熱套（鞏義市予華儀器有限公司）；數顯恒溫水浴鍋ＨＨ－６（常州澳華儀器有限公司）；冰箱（博西華家用電器有限公司）；打煙機（德國ＦＡＢＲＩＱＵＥ ＥＮ ＡＬＬＥＭＡＧＮＥ公司）；ＤＥＬＴＡ－３２０ ｐＨ計、密度檢測器（瑞士ＭＥＴＴＬＥＲ ＴＯＬＥＤＯ有限公司）；無水乙醇、醋酸鈉、葡萄糖、氯化鉀（中國醫藥集團上海化學試劑公司，分析純）；空白煙絲（武漢卷煙廠）。

１．２ 方法

１．２．１ 發酵無花果香料的制備 取無花果加水浸泡一晚，使無花果充分吸水后，在高壓滅菌鍋中１２１ ℃滅菌３０ ｍｉｎ。室溫冷卻后置于３５ ℃烘箱中加溫３０ ｍｉｎ，在超凈工作臺上按０．１５％的質量分數加入生香酵母菌，混合均勻后在生化培養箱內３０ ℃下培養５ ｄ。經過生物發酵后，采用７５％乙醇連續提取３次，發酵無花果和加入的７５％乙醇的比例分別為１∶８、１∶６、１∶６（m∶V，g/mL），時間均為３ ｈ，合并３次濾液。靜置過夜，取上清液濃縮成膏，再用９５％乙醇進行回溶，經冰箱冷凍靜置過夜后過濾。取上清液減壓濃縮至膏狀（相對密度１．４，２０ ℃），制得發酵無花果香料。設置單因素實驗，分別考察接種量、發酵溫度和發酵時間對無花果香料在卷煙中感官評價效果的影響，各因素的梯度設置如下：接種量為０．０５％、０．１０％、０．１５％、０．２０％；發酵溫度為２４、２６、２８、３０、３２ ℃；發酵時間為１、３、５、７ ｄ。

１．２．２ 發酵無花果香料揮發性成分的ＧＣ／ＭＳ分析 取發酵無花果香料５０．０ ｇ，加入３５０ ｍＬ飽和氯化鈉溶液，放入燒瓶中，參照文獻［１４］的方法進行同時蒸餾萃取。將得到的萃取液濃縮至１ ｍＬ，進行ＧＣ／ＭＳ分析。分析條件為色譜柱：ＤＢ－５ＭＳ（３０ ｍ×０．２５ ｍｍ×０．２５ μｍ）毛細管柱；進樣口溫度：２５０ ℃；升溫程序：起始柱溫５０ ℃，保持１０ ｍｉｎ，１０ ℃／ｍｉｎ升溫至２５０ ℃，保持１０ ｍｉｎ；載氣：Ｈｅ，流速１．０ ｍＬ／ｍｉｎ；進樣量：１ μＬ，分流比５０∶１；質譜接口溫度：２５０ ℃；電離方式：ＥＩ；電離能量：７０ ｅＶ；離子源溫度：２３０ ℃；質量掃描范圍：３０～５５０ ａｍｕ。采用Ｗｉｌｅｙ和Ｎｉｓｔ譜庫檢索、人工圖譜解析以及查對質譜相關文獻進行定性，面積歸一化法定量。

１．２．３ 發酵無花果香料在卷煙中的加料試驗 取在溫度（２２±１） ℃和相對濕度６０％±２％下平衡４８ ｈ后的空白煙絲若干份，分別稱取０．０１、０．０２、０．０４ ｇ發酵無花果香料（分別為煙絲質量的０．０２５％、０．０５０％、０．１００％），并分別加入蒸餾水至１．６ ｇ，用喉頭噴霧器分別均勻噴灑于煙絲上，對照樣品噴灑相同質量的蒸餾水。然后將以上煙絲樣品放在溫度（２２±１）℃和相對濕度６０％±２％的條件下平衡４８ ｈ，用填煙器分別將各煙絲樣品制成煙支，挑選質量在（０．９１±０．０２）ｇ范圍內的煙支，再在溫度（２２±１）℃和相對濕度６０％±２％下平衡，請湖北中煙工業有限責任公司評吸委員會評委進行評吸。

１．２．4 發酵無花果香料的熱裂解 稱取約２ ｍｇ發酵無花果香料樣品加入裂解專用石英管中，然后將石英管置于熱裂解儀的加熱絲中，熱裂解條件為初始溫度：３０ ℃；升溫速率：２０ ℃／ｍｓ；持續時間：１０ ｓ；裂解氛圍：氮氣，流量：２．５ ｍＬ／ｓ；分別在３個設定溫度３００、６００和９００ ℃下進行熱裂解。固相微萃取頭置于裂解瓶中對裂解產物進行萃取，萃取時間為１０ ｍｉｎ，萃取溫度為７０ ℃，之后將ＳＰＭＥ進樣針插在氣相色譜的高溫汽化室中進行解吸附，時間２ ｍｉｎ，裂解產物進入氣相色譜／質譜聯用儀進行分離與鑒定，ＧＣ／ＭＳ條件為毛細管柱：ＨＰ－５ＭＳ（３０ ｍ×０．２５ ｍｍ×０．２５ μｍ）；進樣口溫度：２４０ ℃；載氣：Ｈｅ，流速：１ ｍＬ／ｍｉｎ；接口溫度：２５０ ℃；升溫梯度：起始溫度５０ ℃保持１ｍｉｎ，２ ℃／ｍｉｎ升溫至１００ ℃后保持１ ｍｉｎ，８ ℃／ｍｉｎ升溫至２６０ ℃保持５ ｍｉｎ；電離方式：ＥＩ；電離能量：７０ ｅＶ；掃描范圍：３５～６５０ ａｍｕ；標準圖譜庫：Ｎist，Ｗiley譜庫。

２ 結果與分析

２．１ 發酵條件的優化研究

對發酵條件影響因素的單因素實驗結果表明，生香酵母的接種量為０．１５％，發酵溫度為３０ ℃，發酵時間為５ ｄ，得到的無花果香料在卷煙中具有較好的感官評價效果（表１）。

２．２ 發酵無花果香料的ＧＣ／ＭＳ成分分析結果

發酵無花果香料中共鑒定出４１種化合物（表２），占總離子流出峰面積的９７．６９％，其中烴類化合物１３種，酯類化合物９種，羰基類化合物９種，酸類化合物８種，醇類化合物２種。發酵無花果香料含量最高的揮發性成分為酯類化合物，占所有化合物質量的７８．１６％，其中含量較高的幾種酯為：９，１２－十八碳二烯酸乙酯（２６．５２％）、十六酸乙酯（１５．９４％）、９，１２，１５－十八碳三烯酸乙酯（１２．６１％）、十七酸乙酯（１２．３５％）、９，１２－十八碳二烯酸甲酯（６．２９％）；其次為酸類化合物，占化合物總質量的１０．７８％。成分分析結果與文獻報道［１５］有較大差別，可能是由于發酵過程中微生物的作用使得大量的酸類、部分醛酮類化合物轉化為酯類物質。酯類物質具有甜味、水果香味或酒香，與卷煙香氣諧調。大量酯類物質的存在，使發酵無花果香料具有獨特的香氣風格。

２．３ 發酵無花果香料在卷煙中的感官作用效果

將發酵無花果香料按照不同的用量添加到空白煙絲中，進行感官評吸。由表３可知，發酵無花果香料在卷煙中具有增加香氣量、增加煙氣甜潤感、降低刺激和改善余味的作用。加料量為０．０２５％時，香氣量略有增加；加料量為０．０５０％時，香氣量增加明顯，且煙氣甜潤感較好，刺激降低，余味干凈；加料量增加到０．１００％時，則出現壓香，香氣諧調性變差，因此，其合適的用量為煙絲質量的０．０５０％。

２．４ 發酵無花果香料的裂解實驗結果

卷煙熱解蒸餾區的溫度在２００～９００ ℃，煙氣的大部分成分在這個溫度區間產生。３００ ℃時的裂解產物種類少，主要是糠醛、５－甲基2-呋喃糠醛和５－羥甲基呋喃糠醛；而在６００和９００ ℃時裂解產生的物質種類較多，除生成糠醛、５－甲基2-呋喃糠醛和５－羥甲基呋喃糠醛外，還有多種呋喃類、醛類和酮類物質（表４）。其中主要裂解產物糠醛、５－甲基2-呋喃糠醛和５－羥甲基呋喃糠醛具有濃的甜香氣味、甜的焦糖味道；呋喃類物質能增加卷煙的烘烤香；醛類和酮類物質增加卷煙的香氣量和煙香的豐富性。主要裂解產物的感官作用效果與評吸結果較好地吻合。

３ 結論

生香酵母的接種量為０．１５％、發酵溫度為３０ ℃、發酵時間為５ ｄ的發酵條件下得到的無花果香料在卷煙中具有增加香氣量、增加煙氣甜潤感、降低刺激和改善余味的作用，合適的用量為煙絲質量的０．０５０％左右；發酵無花果香料共鑒定出４１種成分，主要有９，１２－十八碳二烯酸乙酯、十六酸乙酯、９，１２，１５－十八碳三烯酸乙酯、十七酸乙酯、９，１２－十八碳二烯酸甲酯、十六酸等化合物；發酵無花果香料熱裂解后產生大量醛類、酮類和呋喃類物質，這些物質是構成卷煙香味的重要成分，能有效改善卷煙吸味。可見發酵無花果香料是一種較好的煙用香料，在中式卷煙中具有良好的應用前景。

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