商洛黃芩內(nèi)生真菌分離鑒定及抗植物病原菌活性篩選

摘要：采用組織分離法從健康黃芩（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ Ｇｅｏｒｇｉ）植株的根、莖、葉中分離獲得３６株內(nèi)生真菌，經(jīng)鑒定隸屬于１２屬，鏈格霉屬為優(yōu)勢(shì)屬。對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離獲得的內(nèi)生菌中有３１株對(duì)一種或多種植物病原菌有不同程度的抑制作用， 占分離菌的８６％；有６株菌對(duì)一種或多種病原菌的抑菌率在７５％以上，占分離菌的 １７％。對(duì)這６株菌培養(yǎng)濾液的抑菌活性也進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明對(duì)峙試驗(yàn)中產(chǎn)生抑菌帶的菌株其培養(yǎng)濾液抑菌活性也高。在６株篩選到的活性菌株中，ＳＢＦ０２和ＳＢＦ０６對(duì)棉立枯病菌抑制效果較好；ＳＢＦ０８和ＳＢＦ２７對(duì)蘋果干腐病菌抑制效果較好； ＳＢＦ１１和ＳＢＦ２７對(duì)茄腐皮病鐮孢霉抑制效果較好；ＳＢＦ０８和ＳＢＦ３２分別對(duì)煙草赤星病菌和草燕麥鐮孢霉抑制效果較好。

關(guān)鍵詞：黃芩（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ Ｇｅｏｒｇｉ）； 內(nèi)生真菌；分離；抑菌活性

中圖分類號(hào)：Ｓ４７６．１ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０11）23－4847-05

Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ Ｆｕｎｇｉ ｆｒｏｍ Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ Ｇｒｏｗｉｎｇ ｉｎ Ｓｈａｎｇｌｕｏ Ｒｅｇｉｏｎ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｅｉｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｔｏ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ

ＪＩ Ｙｕ－ｌｉａｎｇａ，ＬＩ Ｄａｎ－ｑｉｎｇｂ，ＬＩ Ｄｕｉ－ｓｈｕａ，ＺＨＵ Ｇｕａｎｇ－ｑｉａ，ＧＡＯ Ｂａｏ－ｙｕｎａ，ＹＡＮＧ Ｙａ－ｌｉａ

（ａ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ； b. Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ； Ｓｈａｎｇｌｕｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，

Ｓｈａｎｇｌｕｏ ７２６０００， Ｓｈａａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｉｒｔｙ－ｓｉｘ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｏｏｔｓ，ｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｈｅａｌｔｈｙ Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ Ｇｅｏｒｇｉ ｗｉｔｈ ｔｉｓｓｕｅ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ｔｗｅｌｖｅ ｆｕｎｇａｌ ｇｅｎｅｒａ among ｗｈｉｃｈ Aｌｔｅｒｎａｒｉａ waｓ ｔｈｅ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｇｅｎｕｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｒｔｙ－ｏｎｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ， ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ ｆｏｒ 86% ｏｆ ａｌｌ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ， ｃould ｉｎｈｉｂｉｔ ｏｎｅ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｏｒ ｍｏｒｅ ｔｏ ｓｏｍｅ ｅｘｔｅｎｔ； ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｉｘ ｓｔｒａｉｎｓ， ｓｅｖｅｎｔｅｅｎ ｐｅｒｃｅｎｔ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ； was ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ａｔ ｌｅａｓｔ ｔｏ ｏｎｅ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ， ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｒａｔｉｏ higher ｔｈａｎ 75%． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｉｘ ｓｔｒａｉｎｓ’ｓ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｉｌｔｒａｔｅｓ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂａｎｄ ｉｎ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ａｌｓｏ ｓｈｏｗｅｄ ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｉｎｄｉｃａｔｉｖｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｉｌｔｒａｔｅｓ． Among ｓｉｘ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ， ＳＢＦ０２ ａｎｄ ＳＢＦ０６ ｓｈｏｗｅｄ ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ Ｋüｈｎ， ＳＢＦ０８ ａｎｄ ＳＢＦ２７ ｓｈｏｗｅｄ ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔies ｔｏ Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅ ｒｉａｄｏｔｈｉｄｅａ， ＳＢＦ１１ ａｎｄ ＳＢＦ２７ ｓｈｏｗｅｄ ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔies ｔｏ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ（Ｍａｒｔ．）， ａｎｄ ＳＢＦ０８ ａｎｄ ＳＢＦ３２ ｓｈｏｗｅｄ ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔies ｔｏ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ ａｎｄ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ａｖｅｎａｃｅｕｍ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ Ｇｅｏｒｇｉ； eｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ； iｓｏｌａｔｉｏｎ； iｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ

內(nèi)生真菌普遍存在于健康植物各種組織、器官和細(xì)胞間隙內(nèi)，與宿主之間建立了緊密的生態(tài)關(guān)系，產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物對(duì)提高植物對(duì)各種生物和非生物脅迫的抵抗能力發(fā)揮著重要的作用。因此，內(nèi)生菌已成為篩選新型抗生素和其他生理活性物質(zhì)的重要資源［１，２］。尤其近年來隨著人們對(duì)使用化學(xué)農(nóng)藥存在殘留、容易引發(fā)抗性和再猖獗等隱患問題的深刻認(rèn)識(shí)，從藥用植物中分離篩選具有生防作用的內(nèi)生菌以研發(fā)生物農(nóng)藥更是一個(gè)新興的研究熱點(diǎn)［３－５］。

黃芩（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ Ｇｅｏｒｇｉ）為唇形科植物，主要以其根部入藥，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃芩含有４０多種活性成分，具有抗氧化、抗過敏、抗菌、抗病毒等多方面的功效［６］。目前有關(guān)黃芩內(nèi)生真菌抗菌活性的研究主要集中在對(duì)醫(yī)學(xué)病原菌的抑制方面，而對(duì)植物病原菌的抑制研究很少。由于不同地理環(huán)境和氣候條件下內(nèi)生真菌有一定差異，陜西商洛地區(qū)具有從北溫帶向南暖濕帶過渡的地理和氣候特征，黃芩是馳名的五大商藥之一，但對(duì)商洛黃芩內(nèi)生真菌的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)商洛黃芩內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離鑒定，并測(cè)定了內(nèi)生真菌對(duì)５種植物病原菌的抑菌活性，以期獲得具有良好抑菌活性的菌株，為尋找新型抑菌物質(zhì)和研發(fā)生物農(nóng)藥提供依據(jù)。

１ 材料與方法

１．１ 材料

１．１．１ 植物材料 分離內(nèi)生菌所用植物材料為黃芩，于２００９年８月采自商洛香菊藥源基地，取健康植株的根、莖、葉組織樣品，裝入保鮮袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，４ ℃冷藏保存，２ ｄ內(nèi)樣品處理完畢。

１．１．２ 供試植物病原真菌 選用以下５種植物病原菌為供試靶標(biāo)菌：煙草赤星病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ），蘋果干腐病菌（Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅ ｒｉａｄｏｔｈｉｄｅａ），棉立枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ Ｋüｈｎ），茄腐皮病鐮孢霉［Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ（Ｍａｒｔ．）］，草燕麥鐮孢霉（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ａｖｅｎａｃｅｕｍ）。供試植物病原菌由陜西省微生物研究所提供。

１．１．３ 培養(yǎng)基 內(nèi)生真菌的分離純化以及靶標(biāo)菌的培養(yǎng)采用ＰＤＡ固體培養(yǎng)基；內(nèi)生真菌的發(fā)酵用ＰＤＡ液體培養(yǎng)基；內(nèi)生菌的鑒定用查氏培養(yǎng)基和促孢培養(yǎng)基，促孢培養(yǎng)基配方如下：ＫＨ２ＰＯ４ １ ｇ， ＫＮＯ３ １ ｇ， ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５ ｇ，ＫＣｌ ０．５ ｇ，淀粉０．２ ｇ，葡萄糖０．２ ｇ，蔗糖０．２ ｇ，瓊脂２０ ｇ，水１ ０００ ｍＬ， ｐＨ自然。

１．２ 方法

１．２．１ 內(nèi)生真菌的分離與純化 內(nèi)生真菌分離采用組織塊分離法［７，８］。將新鮮黃芩的根、莖、葉用自來水沖洗干凈，分別切成約０．５ ｃｍ的小段（片），每個(gè)部位選標(biāo)樣３２塊，無菌條件下按下列程序進(jìn)行表面消毒：７５％乙醇（１５～２０ ｓ）→無菌水（３～４次）→０．１％的升汞（３～５ ｍｉｎ）→無菌水（４～５次），葉等幼嫩組織處理時(shí)間稍短。再于無菌條件下將上述表面消毒的樣品切成０．２ ｃｍ長的小段或０．２ ｃｍ×０．２ ｃｍ的小片接種于含 ０．０４％氯霉素的ＰＤＡ平板上，置 ２８ ℃恒溫培養(yǎng)５ ｄ 左右。待組織塊斷面邊緣長出菌絲后，根據(jù)菌落形態(tài)和顏色等的不同用接種針挑取尖端菌絲分別移至新的ＰＤＡ培養(yǎng)基上，反復(fù)轉(zhuǎn)接純化，得到純培養(yǎng)菌株，４ ℃保藏備用。

為了檢驗(yàn)對(duì)材料表面消毒是否徹底，以消毒后不做任何切割的樣品作為對(duì)照，于相同條件下培養(yǎng)，如對(duì)照平板無菌絲長出則證明表面消毒滅菌徹底，分離的真菌來自植物組織內(nèi)部，否則分離結(jié)果無效。

１．２．２ 內(nèi)生真菌的形態(tài)觀察與初步鑒定 挑取在ＰＤＡ培養(yǎng)基上純化好的菌株尖端菌絲接種于查氏培養(yǎng)基和產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一段時(shí)間后觀察菌落、菌絲體和孢子的形態(tài)特征，參考有關(guān)文獻(xiàn)將分離的內(nèi)生真菌鑒定到屬［９－１１］。以點(diǎn)植培養(yǎng)法進(jìn)行菌落觀察和常規(guī)鏡檢：用接種針從斜面上取少量孢子，點(diǎn)植于平板上適當(dāng)?shù)奈恢茫怪闷桨逵诤銣叵渲校?２８ ℃培養(yǎng)４、７、１０ ｄ，觀察菌落特征。取少量菌絲，用乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液染色，進(jìn)行常規(guī)鏡檢。

以插片法觀察培養(yǎng)基內(nèi)和氣生菌絲：將真菌接種到平板上，插上滅菌蓋玻片后培養(yǎng)，使真菌菌絲沿著培養(yǎng)基表面與蓋玻片的交接處生長而附著在蓋玻片上。觀察時(shí)輕輕取出蓋玻片置于載玻片上，直接觀察。

以印片法觀察孢子及菌絲體形態(tài)：將要觀察的菌落先印在蓋玻片上，放置于滴有少量乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液的載玻片上直接觀察。

根據(jù)鑒定結(jié)果，計(jì)算內(nèi)生真菌的分離率。

分離率＝某一指定類型內(nèi)生真菌株數(shù)／分離樣品組織塊總數(shù)×１００％

１．２．３ 拮抗真菌的初步篩選 拮抗真菌初步篩選采用對(duì)峙培養(yǎng)法［６，１１］：在無菌條件下將內(nèi)生真菌和供試病原菌活化好，用打孔器制成直徑為０．５ ｃｍ的菌餅分別移至ＰＤＡ平板上，二者相距２．５ ｃｍ，同時(shí)以只接病原菌的平板作對(duì)照，處理和對(duì)照均設(shè)３次重復(fù)，置于２８ ℃下恒溫避光培養(yǎng)。觀察記錄對(duì)峙培養(yǎng)中病原菌菌落的生長和抑菌現(xiàn)象，測(cè)量菌絲擴(kuò)展半徑，根據(jù)抑菌率初步篩選出對(duì)病原菌生長具有抑制作用的內(nèi)生真菌。

抑制率＝（對(duì)照菌落半徑-處理菌落對(duì)峙面半徑）/對(duì)照菌落半徑×１００％

１．２．４ 初篩拮抗真菌培養(yǎng)濾液活性的測(cè)定

１）搖瓶培養(yǎng)：將分離的拮抗作用較好的內(nèi)生真菌在斜面培養(yǎng)基上活化，待生長旺盛后，在無菌條件下用直徑為０．５ ｃｍ的打孔器沿菌落邊緣打下１０塊菌餅，并用接種針挑取接種至含２００ ｍＬ ＰＤＡ液體培養(yǎng)基的５００ ｍＬ錐形瓶中，２８ ℃，１２０ ｒ／ｍｉｎ恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)１０ ｄ后，無菌條件下過濾除去菌絲，濾液用于代謝產(chǎn)物活性的測(cè)定［１２］。

２）活性測(cè)定：按生長速率法，取２０ ｍＬ濾液與１５０ ｍＬ熔化的ＰＤＡ培養(yǎng)基（５０～６０ ℃）混勻制成平板， 接種直徑為０．５ ｃｍ的病原菌菌餅于平板上，以不加濾液的ＰＤＡ平板作對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)３次， ２８ ℃下靜置培養(yǎng)５ ｄ， 測(cè)量菌落直徑， 同時(shí)觀察對(duì)照情況，計(jì)算抑制百分率。

２ 結(jié)果與分析

２．１ 商洛黃芩內(nèi)生真菌的分離與鑒定結(jié)果

從８月份采集的商洛黃芩的９６個(gè)組織塊中分離到３６株內(nèi)生真菌，總分離率為３７．５０％，其中根、莖、葉各分離到１４、１０、１２株，分離率分別為４３．７５％、３１．２５％、３７．５０％。分離菌株經(jīng)鑒定隸屬于１２個(gè)屬，根、莖、葉分別有８、４、５屬，優(yōu)勢(shì)屬為鏈格孢屬，有１２株，占總分離菌的３３．３３％（表１）。總體看來，商洛黃芩中分布的內(nèi)生真菌比較豐富，不同組織部位內(nèi)生真菌的數(shù)量相差不大，但屬種分布存在明顯差異。

２．２ 內(nèi)生真菌對(duì)病原真菌的拮抗作用篩選結(jié)果

對(duì)峙培養(yǎng)測(cè)試表明，商洛黃芩中存在豐富的抗菌活性菌株，分離的３６株內(nèi)生真菌中有３１株對(duì)５種植物病原菌中至少１種有不同程度的拮抗作用，占總分離真菌的８６．１１％（表２）。在活性菌株中，對(duì)蘋果干腐病菌有抑制作用的菌株最多，有２５株，占活性菌株總數(shù)的８０．６５％，且１４株菌抑菌率在６０％以上，其中從葉部分離到的菌株ＳＢＦ２７的抑菌率達(dá)８２．３６％。對(duì)茄腐皮病鐮孢霉、煙草赤星病菌、棉立枯病菌和草燕麥鐮孢霉抑菌率在６０％以上的菌株分別為１２、１０、８和７株，綜合分析得知，３６株分離菌中對(duì)至少１種病原菌的抑菌率在６０％以上的菌株有２１株，占總菌株數(shù)的５８．３３％。

對(duì)峙試驗(yàn)顯示不同內(nèi)生真菌對(duì)同一病原菌的抑制效果差異較大，以對(duì)蘋果干腐病菌的抑制為例，ＳＢＦ２３對(duì)它的抑制率是１５．３１％，而ＳＢＦ２７對(duì)它的抑菌率達(dá)８２．３６％；同一內(nèi)生真菌對(duì)不同病原菌的抑制程度也不相同，如菌株ＳＢＦ０２、ＳＢＦ０８和ＳＢＦ３２對(duì)５種病原菌都有較強(qiáng)的抑菌率，而其他菌株只對(duì)特定的病原菌產(chǎn)生較強(qiáng)的拮抗效應(yīng)，拮抗作用因病原菌的不同表現(xiàn)出較大的差異。可見內(nèi)生真菌對(duì)病原真菌的拮抗作用具有一定選擇性。

此外，從對(duì)峙試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生菌對(duì)病原菌的抑制作用也有多種表現(xiàn)形式。有的內(nèi)生菌對(duì)病原菌產(chǎn)生抑菌帶，在顯微鏡下可以看到病原菌菌絲出現(xiàn)萎縮、斷裂和畸形現(xiàn)象；有的內(nèi)生菌對(duì)病原菌無抑菌帶產(chǎn)生，但接觸時(shí)病原菌菌絲也萎縮、塌陷，不再生長；有的病原菌生長緩慢，內(nèi)生菌生長迅速，很快將病原菌包圍，使病原菌不再生長；個(gè)別病原菌菌落與內(nèi)生真菌接近時(shí)，病原菌在對(duì)峙面停止生長而出現(xiàn)圍繞內(nèi)生真菌的現(xiàn)象。

根據(jù)抑菌率的大小，菌株ＳＢＦ０２（鐮刀菌屬）、ＳＢＦ０６（青霉屬）、ＳＢＦ０８（木霉屬）、ＳＢＦ１１（頭孢霉屬）、ＳＢＦ２７（鏈格孢屬）和ＳＢＦ３２（鏈格孢屬）６株菌至少對(duì)５種病原菌之一的抑菌率在７５％以上，是初步篩選到的高活性菌株。

２．３ 初篩菌株培養(yǎng)濾液的活性測(cè)定結(jié)果

測(cè)定結(jié)果表明，初篩得到的６株菌的培養(yǎng)濾液對(duì)５種病原真菌均有不同程度的抑制作用（表３），其中ＳＢＦ０２和ＳＢＦ０６對(duì)棉立枯病菌，ＳＢＦ０８和ＳＢＦ２７對(duì)蘋果干腐病菌，ＳＢＦ１１和ＳＢＦ２７對(duì)茄腐皮病鐮孢霉，ＳＢＦ０８和ＳＢＦ３２分別對(duì)煙草赤星菌和草燕麥鐮孢霉的抑制率都在６０％以上，抑菌活性最強(qiáng)的是ＳＢＦ２７對(duì)蘋果干腐病菌的抑制，抑制率為７１．３７％。

觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)濾液抑菌活性較高的一般都使病原菌菌落長勢(shì)變慢，氣生菌絲減少，顯微鏡下可見菌絲變短，末端膨大且少有分枝。而對(duì)照菌絲生長正常，菌絲粗壯，分枝較多且有大量分生孢子產(chǎn)生。通過比較培養(yǎng)濾液抑菌活性測(cè)定和對(duì)峙培養(yǎng)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)濾液抑菌活性較高的菌株原來在對(duì)峙培養(yǎng)中抑菌率也高且有抑菌帶產(chǎn)生，如菌株ＳＢＦ０８對(duì)蘋果干腐病菌的抑制等，說明這些菌株對(duì)相應(yīng)病原菌的抑菌活性物質(zhì)是分泌到菌絲外的。但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，有些在對(duì)峙培養(yǎng)中抑菌率較高但無抑菌帶產(chǎn)生的菌株，其培養(yǎng)濾液對(duì)相應(yīng)病原菌的抑菌活性卻比較低，如菌株ＳＢＦ１１對(duì)蘋果干腐病菌的抑制等。這說明它們對(duì)相應(yīng)病原菌的抑制可能是借菌絲的快速生長優(yōu)勢(shì)，與病原菌爭奪空間和營養(yǎng)而產(chǎn)生抑菌作用的。

３ 結(jié)論與討論

對(duì)商洛黃芩內(nèi)生菌的分離鑒定和抗植物病原菌活性測(cè)定結(jié)果表明，商洛黃芩內(nèi)生菌具有豐富的多樣性，屬種分布在根、莖、葉中存在明顯差異，活性菌株的比例也較高；實(shí)驗(yàn)顯示隸屬于不同屬的菌株對(duì)同一病原菌表現(xiàn)出不同程度的拮抗活性，而同一屬的菌株其抗菌范圍以及抗菌活性既相似又有差異。黃芩內(nèi)生菌的多樣性和抗菌活性的選擇性表明其可以作為生防農(nóng)藥開發(fā)的重要資源。實(shí)驗(yàn)篩選出了６株高活性的菌株，其中，ＳＢＦ０２（鐮刀菌屬）和ＳＢＦ０６（青霉屬）對(duì)棉立枯病菌抑制效果較好；ＳＢＦ０８（木霉屬）和ＳＢＦ２７（鏈格孢屬）對(duì)蘋果干腐病菌抑制效果較好；ＳＢＦ１１（頭孢霉屬）和ＳＢＦ２７（鏈格孢屬）對(duì)茄腐皮病鐮孢霉抑制效果較好；ＳＢＦ０８（木霉屬）和ＳＢＦ３２（鏈格孢屬）分別對(duì)煙草赤星病菌和草燕麥鐮孢霉抑制效果較好。這些菌株的種的鑒定有待進(jìn)一步研究，如用分子標(biāo)記方法進(jìn)行聚類分析等。

內(nèi)生菌對(duì)病原菌抑制作用有各種表現(xiàn)形式，在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)峙試驗(yàn)產(chǎn)生抑菌帶的菌株其培養(yǎng)濾液的抑菌活性也較高，病原菌在活性物質(zhì)的作用下，菌落萎縮，菌絲斷裂、消解。關(guān)于活性物質(zhì)的具體成分、性質(zhì)和對(duì)病原菌的作用靶點(diǎn)需要進(jìn)一步提取和分析研究。

內(nèi)生真菌在黃芩中屬種分布的組織差異性可能是由于不同組織的結(jié)構(gòu)、營養(yǎng)、代謝特征等內(nèi)部環(huán)境有別，不同的內(nèi)生菌在黃芩生長過程中承擔(dān)的作用不同，因而使內(nèi)生菌在不同的部位定植。值得注意的是，正是由于內(nèi)生菌和植物建立了密切的生態(tài)關(guān)系，一旦從寄主植物中分離出來后，自身的一些特性也會(huì)隨之改變［１３］。如在試驗(yàn)中經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)，有些活性菌株經(jīng)多次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)或長時(shí)間保存后出現(xiàn)菌種退化、抗菌活性降低等現(xiàn)象，這可能是人工培養(yǎng)基成分和保存條件與植物組織的差異所致。因此，還應(yīng)對(duì)活性菌株的生理生化特性進(jìn)行測(cè)定，以確定內(nèi)生菌離體培養(yǎng)、保存以及產(chǎn)生活性物質(zhì)的最適條件，為生防農(nóng)藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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