酵母發酵虎杖提取白藜蘆醇技術初步研究

摘要：對酵母發酵虎杖（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ）提取白藜蘆醇的原料預處理方式、發酵工藝及提取方法等進行初步研究。結果表明，酵母固態厭氧發酵能有效地提高虎杖白藜蘆醇的提取得率，適量添加纖維素酶和木聚糖酶能在一定程度上提高虎杖白藜蘆醇得率。較佳的虎杖生物發酵提取白藜蘆醇的工藝條件為：虎杖原料粉碎過１０目篩，發酵體系含水的質量分數為６５％，添加糖化酶Ⅱ和ＳＡＤＹ酵母的量分別占虎杖原料質量的０．１８％和０．３４％，厭氧發酵５ ｄ，發酵后采用體積分數為９５％的乙醇水溶液提取。

關鍵詞：虎杖（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ）；白藜蘆醇；酵母發酵；提取

中圖分類號：Ｒ２８４．２ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）23－4929-03

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ｆｒｏｍ Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ ｂｙ Ｙｅａｓｔ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ

ＰＥＮＧ Ｙｕａｎ－ｄｅ１，ＺＨＵ Ｚｕｏ－ｈｕａ１，ＬＩＵ Ｚｈｅｎｇ－ｃｈｕ１，ＤＵＡＮ Ｓｈｅｎｇ－ｗｅｎ１，ＬＩ Ｚｈｉ－ｍｉｎ１，ＹＡＮ Ｌｉ１，

ＱIN Ｌｉａｎ－ｃｈｅｎｇ２，ＷＥＩ Ｊｉｅ－ｚｈｏｎｇ２

（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂａｓｔ Ｆｉｂｅｒ Ｃｒｏｐｓ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０２０５， Ｃｈｉｎａ；

２．Ｈｕａｙｕａｎ Ｈｅｎｇｙｕａｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ.， Ｈｕａｙｕａｎ ４１６４００， Ｈｕｎａｎ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ， ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ｆｒｏｍ Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｂｙ ｓｏｌｉｄ ｓｔａｔｅ anaerobic ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ． Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ａｎｄ ｘｙｌａｎａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｕｌｄ ａｌｓｏ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ， Ｐ． ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ ｓａｍｐｌｅ ｇｒｉｎｄｅｄ ｉｎｔｏ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｉｎｅｒ ｔｈａｎ １０ ｍｅｓｈ； Mａｓｓ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ６５％； Dｏｓｅ ｏｆ ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ Ⅱ ａｎｄ ＳＡＤＹ， ０．１８％ ａｎｄ ０．３４％ ｏｆ Ｐ． ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ ｗｅｉｇｈｔ； Anaerobic ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ５ ｄ； Eｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｓｏｌｖｅｎｔ， ９５％ ａｌｃｏｈｏｌ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ； ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ； ｙｅａｓｔ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ

白藜蘆醇是一類具有重要生物學作用的植物性化合物，具有預防和抗心血管疾病、抑菌、抗氧化、抗腫瘤等多種功能［１－３］，市場前景廣闊。虎杖（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｃｕｓｐｉｄａｔｕｍ）是蓼科多年生草本植物［４－６］，是目前提取白藜蘆醇的首選天然植物［７］。研究虎杖中白藜蘆醇高效提取技術對推動我國特色經濟發展具有重要的意義。目前國內一般先采用有機溶劑提取白藜蘆醇苷，再用酸、堿等去除苷上的糖使之轉化為苷元，最終完成白藜蘆醇的提取。該方法費時、難度大、成本高，而且存在污染環境的問題［８］。近年來國內科研人員開始利用酶法［９－１２］、超臨界ＣＯ２萃取［７］、微波［１３］等技術提取白藜蘆醇。本研究利用酵母菌株進行虎杖固態發酵，再用有機溶劑提取，對發酵及提取工藝進行了初步研究，以期得到較高的白藜蘆醇得率。

１ 材料與方法

１．１ 材料與儀器

１．１．１ 材料與試劑 虎杖、酵母ＳＸＸ及糖化酶Ⅰ干樣由花垣恒遠植物生化有限責任公司提供，虎杖干樣粉碎成直徑０．５～１．０ ｃｍ的小塊備用；ＡＤＹ、SADY、ＳＡＧ、ＤＢＡ為市售干酵母；糖化酶Ⅱ為山東酶制劑廠（山東隆大生物工程有限公司）提供；纖維素酶和木聚糖酶由湖南尤特爾生化有限公司提供，酶活力分別為２ ０００和５ ０００ Ｕ／ｍＬ；面粉購自當地市場。

１．１．２ 主要儀器設備 高效液相色譜儀、分析天平、精密ｐＨ計、恒溫搖床、移液器、計時器、蒸汽爆破裝置和高壓滅菌鍋等。

１．２ 實驗方法

１．２．１ 酵母活化液制備 ３００ ｍＬ三角瓶中裝入１００ ｍＬ水、４．２0 ｇ面粉、０．１７ ｇ酵母和０．０９ ｇ糖化酶Ⅰ，３０ ℃振蕩培養２４ ｈ，備用。

１．２．２ 虎杖的酵母發酵及白藜蘆醇提取 取５０ ｇ虎杖干樣裝入３００ ｍＬ三角瓶中，加入１００ ｍＬ ＳＸＸ酵母活化液混勻，此時發酵體系中酵母和糖化酶的用量分別為虎杖干樣質量的０．３４％和０．１８％，調整發酵體系含水量使其中水的質量分數為６５％，置于３５ ℃恒溫箱中培養，每隔２４ ｈ取樣，按料液比１∶８（m∶Ｖ，ｇ／ｍＬ）加入體積分數為３５％的乙腈水溶液浸泡提取１２ ｈ，測定白藜蘆醇的得率，以不經發酵的虎杖干樣為對照。

設置單因素實驗考察發酵方式（有氧／厭氧）、發酵體系含水量、酶制劑、原料預處理方式、酵母品種和提取劑對白藜蘆醇得率的影響。①發酵方式。將裝有發酵體系的三角瓶分為兩組，一組用透氣的硅膠塞塞住瓶口（有氧發酵），另一組用不透氣的薄膜封瓶口（厭氧發酵）。②發酵體系含水量。調節發酵體系含水量（水的質量分數，下同）分別為６０％、６５％、７０％，用薄膜密封瓶口發酵。③酶制劑。酵母活化液中發酵體系中分別加入０．９ ｇ／Ｌ糖化酶Ⅰ、０．９ ｇ／Ｌ糖化酶Ⅱ、０．９ ｇ／Ｌ糖化酶Ⅰ＋２ ｇ／Ｌ纖維素酶或０．９ ｇ／Ｌ糖化酶Ⅰ＋２ ｇ／Ｌ纖維素酶＋２ ｇ／Ｌ木聚糖酶混勻，每５０ ｇ虎杖干樣中加入１００ ｍＬ酵母活化液，發酵４或５ ｄ后取樣，使用體積分數９５％的乙醇水溶液浸泡提取。④原料預處理方式。將虎杖原料進行不同的處理：粉碎（過１０目篩）、紫外（３０ Ｗ，距離１０ ｃｍ，照射４５ ｍｉｎ）、汽爆（汽爆壓力２．０ ＭＰａ，維壓時間６０ ｓ）和微波（３０ ｓ），處理后進行酵母發酵，４或５ ｄ后取樣使用體積分數９５％的乙醇水溶液浸提。⑤酵母品種。分別用ＳＸＸ、ＡＤＹ、ＳＡＤＹ、ＳＡＧ、ＤＢＡ酵母配置活化液發酵虎杖，酵母用量均為虎杖干樣質量的０．３４％，發酵４或５ ｄ后取樣，使用體積分數９５％的乙醇水溶液浸提白藜蘆醇。⑥提取劑。發酵體系加入ＳＸＸ酵母活化液用薄膜密封瓶口發酵４或５ ｄ后，分別采用體積分數為３５％的乙腈水溶液和體積分數９５％的乙醇水溶液浸提。

１．３ 分析方法

采用高效液相色譜法分析虎杖發酵白藜蘆醇得率，統一換算成原料含水的質量分數為１５％時白藜蘆醇的質量分數。

２ 結果與分析

２．１ 發酵方式對白藜蘆醇得率的影響

不經發酵直接從虎杖中提取白藜蘆醇，得率為０．６７０％；通過酵母發酵，白藜蘆醇得率得到了較大的提高（圖１），其中厭氧發酵４ ｄ，白藜蘆醇得率最高，達１．２３０％，相比對照提高了８３．５８％。薄膜密封的厭氧發酵提取效果好于用硅膠塞的有氧發酵，原因可能是厭氧條件抑制了霉菌等雜菌的繁殖，降低了酵母的呼吸作用，更有利于發酵。

２．２ 發酵體系含水量及發酵時間對白藜蘆醇得率的影響

白藜蘆醇得率隨發酵體系含水量的變化及發酵時間的延長有較大變化（圖２）。含水量為６０％時，白藜蘆醇得率最低；發酵體系含水量為７０％、發酵時間為６ ｄ時，白藜蘆醇得率最高，為１．４５７％，與含水量為６５％、發酵５ ｄ時的得率（１．４５４％）相差不大，因此，本研究采用６５％的含水量，發酵時間５ ｄ。

２．３ 酶制劑對白藜蘆醇得率的影響

不同的酶制劑對白藜蘆醇得率影響不同（圖３），添加糖化酶Ⅱ、發酵５ ｄ效果最好，使用糖化酶Ⅰ的同時添加纖維素酶和木聚糖酶可在一定程度上提高白藜蘆醇得率。

２．４ 原料預處理對白藜蘆醇得率的影響

預處理方式對白藜蘆醇得率有一定影響（圖４），其中將虎杖粉碎后再發酵提取的得率最高，原因可能是小顆粒增大了虎杖的比表面積，有利于酵母的作用；汽爆處理后白藜蘆醇含量降低明顯，原因可能為汽爆處理后原料水分含量過高，另外，汽爆的高溫破壞了虎杖中化合物的結構，產生了不利于酵母發酵的物質，從而抑制了白藜蘆醇的產生。

２．５ 酵母品種對白藜蘆醇得率的影響

不同的酵母品種對白藜蘆醇得率有較大的差異，ＳＡＤＹ、ＤＢＡ和ＳＸＸ酵母發酵效果較好（圖５），使用各種酵母發酵虎杖５ ｄ后提取白藜蘆醇，得率均高于發酵４ ｄ，其中ＳＡＤＹ酵母發酵后得率最高，達１．８８０％，其次是ＤＢＡ（１．８００％）和ＳＸＸ（１．７８０％）。

２．６ 提取劑對白藜蘆醇得率的影響

由圖６可以看出，用體積分數為９５％的乙醇水溶液浸泡發酵后的虎杖提取白藜蘆醇，得率明顯高于體積分數為３５％的乙腈水溶液浸提時的得率。

３ 結論

通過酵母固態發酵，能在很大程度上提高虎杖中白藜蘆醇的提取率，原因可能是酵母可以將虎杖原料中的虎杖苷等代謝為白藜蘆醇。本研究顯示，發酵方式、酵母品種、酶制劑、原料預處理方式、發酵體系含水量和浸提劑等都對酵母發酵虎杖提取白藜蘆醇的得率有影響。ＳＡＤＹ、ＤＢＡ和ＳＸＸ酵母是比較適合發酵虎杖提取白藜蘆醇的酵母品種，發酵過程應使用厭氧發酵；糖化酶Ⅱ作用效果優于糖化酶Ⅰ，在使用糖化酶Ⅰ的同時添加纖維素酶和木聚糖酶能促進白藜蘆醇的提取；將虎杖原料粉碎后再發酵提取，可以提高白藜蘆醇得率，氣爆不利于白藜蘆醇的提取；發酵體系中水的質量分數為６５％，發酵５ ｄ可以得到較高的提取率；使用體積分數為９５％的乙醇水溶液作提取劑，白藜蘆醇得率明顯高于以體積分數為３５％的乙腈水溶液為提取劑。

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