白甲魚不同組織同工酶的組織特異性研究

摘要：采用聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳，對白甲魚（Ｏｎｙｃｈｏｓｔｏｍａ ｓｉｍａ）的腦、眼、心臟、肝臟、腎臟和肌肉６種組織的乳酸脫氫酶（ＬＤＨ）、酯酶（ＥＳＴ）和蘋果酸脫氫酶（ＭＤＨ）３種同工酶進行了初步研究。結果表明，不同組織中３種同工酶均存在比較明顯的組織特異性。Ｌｄｈ－ＡＢ３和Ｌｄｈ－Ｂ４在腦、眼、心臟和腎臟４種組織中均優勢表達，Ｌｄｈ－Ａ４和Ｌｄｈ－Ａ３Ｂ在腎臟和肌肉中優勢表達；ＥＳＴ同工酶在肝臟中酶帶條數最多且活性最強，在眼和肌肉中活性最弱；ＭＤＨ同工酶在肝臟和腎臟中只存在上清液型（ｓ－ＭＤＨ），但活性較強。

關鍵詞：白甲魚（Ｏｎｙｃｈｏｓｔｏｍａ ｓｉｍａ）；同工酶；組織特異性

中圖分類號：Ｑ９５９．４６＋８；Ｑ５５ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）23－4912-04

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｉｓｏｚｙｍｉｃ Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｔｉｓｓｕｅｓ ｉｎ Ｏｎｙｃｈｏｓｔｏｍａ ｓｉｍａ

ＷＡＮＧ Ｈｏｎｇ－ｙｅ１，２，ＺＨＡＮＧ Ｊｕａｎ１，２，ＣＡＩ Ｙａｎ－ｚｈｉ２，ＬＵ Ｔａｏ３，ＱＩＮ Ｘｉａｏ－ｙａｎ３

（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７９， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｕｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｗｕｈａｎ ４３００７１， Ｃｈｉｎａ；

３． Ｚｉｇｕｉ Ｇｏｖｅｒｎｉｎｇ Ｓｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｆｉｓｈｅｒｙ Ａｄｍｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｖｅｓｓｅｌ Ｃｈｅｃｋｉｎｇ ａｎｄ Ｐｏｒｔ Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ， Ｚｉｇｕｉ ４４３６００， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｉｓｏｚｙｍｉｃ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ＬＤＨ， ＥＳＴ ａｎｄ ＭＤＨ ｉｎ 6 ｔｉｓｓｕｅｓ （ｂｒａｉｎ，ｅｙｅｓ，ｈｅａｒｔ，ｌｉｖｅｒ，ｋｉｄｎｅｙ ａｎｄ ｍｕｓｃｌｅ） ｏｆ Ｏｎｙｃｈｏｓｔｏｍａ ｓｉｍａ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｖｅｒｔｉｃａｌ ｐｏlｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （ＰＡＧＥ）. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｓｏｚｙｍｉｃ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ 3 ｅｎｚｙｍｅｓ ｈａｄ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ. Ｌｄｈ－Ｂ４ ａｎｄ Ｌｄｈ－ＡＢ３ ｉｓｏｚｙｍｉｃ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ 4 ｔｉｓｓｕｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ， ｅｙｅs， ｈｅａｒｔ ａｎｄ ｋｉｄｎｅｙ． Ｔｈｅ Ｌｄｈ－Ａ４ ａｎｄ Ｌｄｈ－Ａ３Ｂ ｉｓｏｚｙｍｉｃ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｋｉｄｎｅｙ ａｎｄ ｍｕｓｃｌｅ； Tｈｅ ｍｏｓｔ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＥＳＴ ｉｓｏｚｙｍｉｃ ｂａｎｄｓ ｗａｓ ａｐｐｅａｒｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ，ｔｈｅ ｌｏｗｅｓｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ａｐｐｅａｒｅｄ ｉｎ ｂｏｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｅｙｅｓ ａｎｄ ｍｕｓｃｌｅ； Oｎｌｙ ｓ－ＭＤＨ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｋｉｄｎｅｙ， ａｎｄ ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ weｒｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｈｉｇｈ.

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｏｎｙｃｈｏｓｔｏｍａ ｓｉｍａ； ｉｓｏｚｙｍｅ； ｔｉｓｓｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ

同工酶是一組能夠催化同一種生化反應但分子一級結構不同的酶，是基因表達的產物。同一物種的不同個體或同一個體的不同組織以及生物的不同發育階段、不同代謝條件下都有同工酶分布［１，２］。魚類同工酶的遺傳學研究開始于２０世紀６０年代初期，現已證明硬骨魚類的同工酶系統具有明顯的組織特異性［３，４］。同工酶作為一種生化遺傳指標，廣泛地用于魚類物種鑒定、種群遺傳多樣性分析、系統發育及生化遺傳等各個方面［５］。

白甲魚［Ｏｎｙｃｈｏｓｔｏｍａ ｓｉｍａ（Ｓａｕｖａｇｅ ｅｔ Ｄａｂｒｙ）］，地方名白甲、突吻魚、毛白甲，隸屬鯉形目（Ｃｙｐｒｉｎｉｆｏｒｍｅｓ）鯉科（Ｃｙｐｒｉｎｉｄａｅ）鲃亞科（Ｃｙｐｉｎｉｄａｅ）白甲魚屬（Ｏｎｙｃｈｏｓｔｏｍａ），主要分布于長江水系的干流及支流，具有半洄游習性，屬底棲魚類，為長江流域土著名優經濟魚類之一［６］，其肉質細嫩、味道鮮美、營養豐富，頗受消費者的喜愛［７］。目前，有關白甲魚生化遺傳方面的研究較少，主要集中于生物學特性及繁育養殖技術等方面，而關于其同工酶表達方面的研究尚未見報道。本研究采用聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳，對白甲魚６種組織中的乳酸脫氫酶、酯酶和蘋果酸脫氫酶３種同工酶進行了電泳分析，旨在為進一步研究白甲魚的遺傳特性、種質鑒別及生物進化等方面提供一定的理論依據，并為其人工選種和定向育種提供生化遺傳學指標。

１ 材料與方法

１．１ 材料

１．１．１ 實驗魚 實驗用白甲魚來源于嘉陵江、沱江以及人工飼養的魚種，選擇符合白甲魚生物學性狀、體格健壯、體表無傷的大規格魚種共９０尾，平均體長（１７．９±１．１） ｃｍ，平均體重（１２７．８±２７．１） ｇ。

１．１．２ 儀器與試劑 玻璃研磨器；ＹＰ２０２Ｎ型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；ＦＡ２００４型電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；ＧＬ２０－Ｂ型高速冷凍離心機（中國科學院武漢科學儀器廠）；ＤＹＹ－１０Ｃ型穩壓穩流電泳儀（北京市六一儀器廠）；－２０ ℃低溫冰箱；ＬＲＨ－２５０－Ｚ型生化培養箱（廣東省醫療器械廠）等。

３０％丙烯酰胺；Ｎ，Ｎ′—甲叉雙丙烯酰胺；過硫酸銨；四甲基乙二胺；三羥甲基氨基甲烷等。

１．２ 方法

１．２．１ 樣品制備 首先將活魚鰓弓基部剪斷于水中放血，置于冰上解剖，取出腦、眼、心臟、肝臟、腎臟和肌肉６種組織，用冰凍無菌蒸餾水沖洗以除去組織血污，然后用濾紙輕輕吸去多余水分。分別取上述６種組織稱重后，按１∶３的比例（質量體積比）加入０．１ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ７．０的磷酸鹽緩沖液（用時稀釋１０倍），并置于玻璃勻漿器中冰浴勻漿。得到的勻漿于４ ℃冰箱內靜置１ ｈ后進行分離，將勻漿液轉入離心管，按２∶１的體積比加入氯仿以去除脂類雜質，振蕩混勻后４ ℃放置１０ ｍｉｎ，１５ ０００ ｒ／ｍｉｎ ４ ℃低溫離心３０ ｍｉｎ，取上清液于新離心管中，即為提取的同工酶樣品。按１∶１的體積比加入丙三醇，置－２０ ℃冰箱中保存備用。

１．２．２ 電泳 采用７．５％的聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳法（ＰＡＧＥ）分析，濃縮膠濃度為５％。電極緩沖液為Ｔｒｉｓ－甘氨酸溶液（ｐＨ ８．３）。

電泳分為預電泳和電泳兩個步驟。預電泳時在電泳槽的上下槽中加入電極緩沖液，插上電極，接通電源，在４ ℃、５０ Ｖ的電壓下預電泳３０ ｍｉｎ；按樣品與指示劑（２０％的蔗糖溶液加適量的溴酚藍）１∶１的體積比點樣，點樣后將電壓升高至１００ Ｖ繼續電泳，直至接近液面時停止電泳。

１．２．３ 染色和固定 乳酸脫氫酶同工酶、酯酶同工酶及蘋果酸脫氫酶同工酶的染色方法參照文獻［８－１０］的方法略作修改。染色液現用現配且要過濾。電泳結束后將凝膠小心地取下，于３７ ℃染色液中避光染色，直至酶帶呈現的比較清晰。顯色完成后用７％的冰醋酸溶液固定，數碼相機拍照。

１．２．４ 同工酶的命名 同工酶的命名以同工酶縮寫名稱代表酶蛋白，按電泳遷移率的順序依次命名［１１］。乳酸脫氫酶以Ａ、Ｂ、Ｃ表示；酯酶和蘋果酸脫氫酶以１，２，３……依次表示陽極到陰極各遷移位點。

２ 結果與分析

２．１ 乳酸脫氫酶（ＬＤＨ）

白甲魚６種組織中ＬＤＨ同工酶酶帶的組成及活性均有所不同，表現出比較明顯的組織特異性。肝臟的酶帶比較豐富，多達７條，陰極端顯現出Ｌｄｈ－Ｃ條帶；腦有６條酶帶；眼、心臟和腎臟都表現為５條典型的酶帶，但是活性不同；肌肉最少，為４條酶帶（圖１）。Ｌｄｈ－ＡＢ３和Ｌｄｈ－Ｂ４在腦、眼、心臟和腎臟中優勢表達，活性較強；肝臟次之；肌肉最弱。Ｌｄｈ－Ａ４和Ｌｄｈ－Ａ３Ｂ在腎臟和肌肉中優勢表達；心臟和肝臟中活性次之；眼相對較弱；腦最弱。Ｌｄｈ－Ａ２Ｂ２在肝臟和肌肉中缺失。此外，Ｌｄｈ－Ａ２Ｂ２在腦中具有一條附帶，肝臟的陽極端也出現２條附帶。附帶可能是ＬＤＨ同工酶復等位基因表達或合成后酶亞基修飾的結果。

２．２ 酯酶（ＥＳＴ）

白甲魚ＥＳＴ同工酶酶帶條數在6種組織中存在差異，可檢測到共１０條酶帶（圖２）。腦和肝臟多達７條酶帶，腎臟有５條，心臟有４條，眼和肌肉最少，為２條。ＥＳＴ同工酶在６種組織中均表現出一定的活性，但是活性均不相同。除了眼和肌肉外，其他組織中的ＥＳＴ酶活性均較強。腦、心臟、肝臟、腎臟和肌肉中有共同的酶帶如ＥＳＴ－８和ＥＳＴ－９，但在各組織中表現出明顯的組織特異性。ＥＳＴ同工酶酶譜可明顯分為３個區域，說明白甲魚的ＥＳＴ同工酶可能至少有３個基因位點。在Ｌ１區，眼和肌肉缺失ＥＳＴ－１０，且ＥＳＴ－９在心臟、肝臟和腎臟中的活性最強，腦次之，眼和肌肉最弱。在Ｌ２區，眼缺失ＥＳＴ－７和ＥＳＴ－８兩條帶，肌肉缺失ＥＳＴ－７；ＥＳＴ－７和ＥＳＴ－８在肝臟和腎臟中的活性均較強，心臟次之，腦相對較弱。在Ｌ３區組織特異性最明顯，腦和肝臟都有３條酶帶，腦中表達ＥＳＴ－３、ＥＳＴ－４和ＥＳＴ－５；肝臟中表達ＥＳＴ－１、ＥＳＴ－３和ＥＳＴ－６；眼和腎臟各有１條酶帶，分別為ＥＳＴ－４和ＥＳＴ－２；心臟和肌肉中未檢測到酶帶。

２．３ 蘋果酸脫氫酶（ＭＤＨ）

ＭＤＨ同工酶是一種二聚體，存在上清液型（ｓ－ＭＤＨ）和線粒體型（ｍ－ＭＤＨ）２種。白甲魚的ＭＤＨ同工酶具有較為明顯的組織特異性。腦、眼、心臟和肌肉中２種類型的ＭＤＨ都存在，而肝臟和腎臟中只有ｓ－ＭＤＨ（圖３）。ＭＤＨ－１和ＭＤＨ－７在眼睛中特異性表達，ＭＤＨ－５在腦中特異性表達。ＭＤＨ－２和ＭＤＨ－３在心臟、肝臟和腎臟中優勢表達，在眼中的活性次之，在肌肉中的活性最弱；其中ＭＤＨ－２也在腦中優勢表達，但腦缺失ＭＤＨ－３。

３ 討論

魚類同工酶的組織特異性強［７］，對白甲魚３種同工酶的初步研究表明，白甲魚的６種組織中存在著比較豐富的酶系統，并且在酶帶的組成和活性上表現出比較明顯的組織特異性，可能與所在的組織或器官的生理功能相關。

３．１ ＬＤＨ同工酶組織特異性分析

ＬＤＨ同工酶為四聚體蛋白，是目前研究的比較深入的一種同工酶。魚類的ＬＤＨ為四聚體酶，大多由Ａ、Ｂ、Ｃ ３個位點控制［１２］，分別編碼Ａ、Ｂ、Ｃ ３種亞基。在通常情況下由Ａ、Ｂ兩個基因編碼產生２種亞基組成５種四聚體結構［１３，１４］。Ａ、Ｂ亞基在大多數組織中均存在，Ｃ亞基僅存在于特定的組織如肝臟［１５］。白甲魚ＬＤＨ同工酶組織特異性較明顯，可能與不同組織的生理功能相關，如Ｌｄｈ－Ａ４在肌肉中優勢表達，在無氧條件下能將糖酵解產生的丙酮酸還原為乳酸，維持機體的能量需要；Ｌｄｈ－Ｂ４可以使還原型輔酶Ｉ高效地氧化呼吸，其在心臟中優勢表達，是有氧代謝的必要條件［７］。白甲魚的肝臟中ＬＤＨ同工酶酶帶高達７條，在陰極端顯現出Ｌｄｈ－Ｃ條帶。Ｌｄｈ－Ｃ基因僅在白甲魚肝臟中特異性表達，可能是與代謝旺盛的肝臟相適應。白甲魚行動比較活躍，大多棲息于水流較湍急，底質多礫石的江段［６］，因此需要大量的能量，Ｌｄｈ－Ｃ基因的出現，與其生活特性相適應。

３．２ ＥＳＴ同工酶組織特異性分析

魚類的ＥＳＴ同工酶比較復雜，一般認為是單體，由多個位點編碼［１６，１７］。白甲魚ＥＳＴ同工酶酶譜較復雜，６種組織中均表現出一定的ＥＳＴ酶活性，但各組織中的活性有所差異。除了眼睛和肌肉外，其他組織中的酶活性均較強，其中肝臟中的活性最強，在Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３三個區域中均有表達，尤其是在Ｌ３區，肝臟具有特異性條帶ＥＳＴ－１和ＥＳＴ－６；腦也有特異條帶ＥＳＴ－５以及腎臟有特異性條帶ＥＳＴ－２。在Ｌ１和Ｌ２區，心臟、肝臟和腎臟酶帶顏色較深，表明其ＥＳＴ酶活性較強。眼和肌肉在三個區域均有條帶缺失，表明其ＥＳＴ酶活性相對最弱。白甲魚ＥＳＴ同工酶表現出比較明顯的組織特異性，可能與各組織的生理功能有密切聯系。ＥＳＴ同工酶是催化酯類化合物水解進入中間代謝的重要水解酶酶系，在細胞內執行最基本的生理功能［１１］，在維持細胞正常的能量代謝方面具有重要的作用。而心臟含有大量的線粒體，為維持機體的血液循環和其他代謝活動提供能量。白甲魚比較活躍，能量需求大，與其功能相適應，因而ＥＳＴ同工酶在心臟中活性比較強。除了維持細胞正常的能量代謝外，ＥＳＴ同工酶還能水解大量的非生理存在的酯類化合物，可能與其參與機體的解毒作用密切相關［１２］。ＥＳＴ同工酶在肝臟中酶帶數量最多，表達活性也較強，與其功能相適應。肝臟是機體最大的毒物清除器官，物質代謝活躍，因此ＥＳＴ同工酶在肝臟中較強表達。在腦中的條帶也最多，表明其ＥＳＴ酶活性較強，可能與腦細胞活躍的能量代謝有關。

３．３ ＭＤＨ同工酶組織特異性分析

硬骨魚類的ＭＤＨ為二聚體，存在ｓ－ＭＤＨ和ｍ－ＭＤＨ兩種類型，均是由２個基因編碼的二聚體［７］。白甲魚的腦、眼和肌肉的ｓ－ＭＤＨ均表達為３條酶帶，ｍ－ＭＤＨ為１條酶帶；心臟、肝臟和腎臟的ｓ－ＭＤＨ均表達為２條酶帶，其中肝臟和腎臟的ｍ－ＭＤＨ不表達。白甲魚各組織兩種類型的ＭＤＨ分別檢測出１～３條酶帶，與理論上二聚體兩個基因編碼最多形成３條酶帶相符，因此其ＭＤＨ同工酶也符合典型的二聚體結構。白甲魚的ＭＤＨ同工酶具有組織特異性，腦、眼、心臟和肌肉中存在兩種類型的ＭＤＨ，肝臟和腎臟中缺失ｍ－ＭＤＨ；ｓ－ＭＤＨ在心臟、肝臟、腎臟中的活性較強，腦的活性次之，其次是眼，肌肉的活性最弱。白甲魚是一種生活于江河流水水體中的魚類，各組織中都有較高的ＭＤＨ同工酶活性，可能與其生存的生態環境相適應。

３．４ 白甲魚同工酶組織特異性原因探析

通過對白甲魚不同組織同工酶的初步研究表明，白甲魚６種組織中的３種同工酶存在不同程度的組織差異，主要表現在酶譜條帶的多少以及酶譜條帶的強弱兩個方面。以ＬＤＨ同工酶和ＥＳＴ同工酶為例，白甲魚肝臟中的ＬＤＨ同工酶條帶數最多，達到了７條；而肌肉的條帶數則少于５條，但是Ｌｄｈ－Ａ４和Ｌｄｈ－Ａ３Ｂ在肌肉中酶譜條帶染色最深，優勢表達。肝臟和肌肉兩種組織都缺失Ｌｄｈ－Ａ２Ｂ２條帶。白甲魚的腦、心臟、肝臟、腎臟的ＥＳＴ同工酶在Ｌ１區和Ｌ２區的酶譜相似；但是在Ｌ３區，腦臟和肝臟都有３條酶帶且活性都較強；腎臟有１條酶帶且活性較弱。這些差異的產生，可能是由于不同組織中編碼同工酶位點的基因沒有同時表達，造成組織之間酶譜條帶數量不同。再者，即使這些基因同時表達但活性強弱表達程度不同，或者表達后由于各組織執行不同的生理功能，也會造成酶譜條帶強弱的差異［１８］。

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