茶樹DＮA的快速抽提法

摘要：使用簡化改良的ＣＴＡＢ法抽提茶樹（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）鮮葉ＤＮＡ，通過電泳和ＰＣＲ檢測所提取ＤＮＡ的質(zhì)量。實驗結(jié)果表明，改良的ＣＴＡＢ法提取茶樹ＤＮＡ，步驟減少、抽提過程簡單、時間短、效率高，用嫩葉和成熟葉均能抽提出高質(zhì)量的ＤＮＡ。

關鍵詞：茶樹（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）；ＤＮＡ快速抽提；ＣＴＡＢ法；鮮葉保存

中圖分類號：Ｓ５７１．１；Ｑ５２３ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）23－4962-03

Ａ Ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｔｅａ

ＣＨＥＮ Ｚｈｉ－ｈｕｉ，ＺＨＯＮＧ Ｑｉｕ－ｓｈｅｎｇ，ＬＩＮ Ｚｈｅｎｇ－ｈｅ，ＹＯＵ Ｘｉａｏ－ｍｅｉ，ＣＨＥＮ Ｃｈａｎｇ－ｓｏｎｇ

（ Tｅａ Rｅｓｅａｒｃｈ Iｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Fｕｊｉａｎ Aｃａｄｅｍｙ ｏｆ Aｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Sｃｉｅｎｃｅ，Ｆｕａｎ ３５５０００，Ｆｕｊｉａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｍｅｌｉｏｒａｔｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｅａ ｌｅａｖｅｓ， ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ ＰＣＲ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｆ ｂｒａｎｃｈｅｓ ｉｎ ｗａｔｅｒ ｈａｄ ｎｏ ｏｂｖｉｏｕｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ． Ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｆａｓｔ ａｓ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｆｒｏｍ ｔｅｎｄｅｒ ｌｅａｖｅｓ ｂｕｔ ａｌｓｏ ｆｒｏｍ ｍａｔｕｒｅ ａｎｄ ｏｌｄ ｌｅａｖｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｔｅａ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）； ＤＮＡ ｒａｐｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； ＣＴＡＢ method； ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｓｈ ｌｅａｖｅｓ

茶樹（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）ＤＮＡ抽提技術(shù)是茶樹分子生物學研究的基礎［１－３］，茶樹富含多酚和多糖等多種次生代謝物質(zhì)，使得提取高質(zhì)量的ＤＮＡ較為困難。目前茶樹ＤＮＡ抽提基本參考其他植物的抽提方法，主要有ＳＤＳ法［４，５］、ＣＴＡＢ法［６－9］等，這些方法對樣品保存條件要求較為苛刻，常見的保存條件有冰塊、超低溫、液氮或硅膠脫水干燥等，葉片研磨要求放在冰上或者用液氮研磨，抽提步驟復雜，使用試劑多，抽提時間長［７－１2］。此外，在野外采樣時使用冰塊、液氮或超低溫保存樣品不太現(xiàn)實，增加了后續(xù)ＤＮＡ提取的難度。本實驗采用枝梢保鮮法保存樣品，同時簡化和改良ＣＴＡＢ法抽提ＤＮＡ的步驟，抽提過程簡單，時間縮短，并能獲得高質(zhì)量的ＤＮＡ，可有效解決樣品運輸保存和抽提中遇到的問題。

１ 材料與方法

１．１ 材料及保存方法

國家級茶樹品種丹桂（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ｃｖ． Ｄａｎｇｕｉ）和鐵觀音（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ｃｖ． Ｔｉｅｇｕａｎｙｉｎ）采自福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所２號山茶園，春茶采摘后修剪長出的1芽５葉新梢。取樣時每個樣品保存1根枝梢，直接在枝條或葉片上用油性記號筆編號，捆綁成束，在枝條剪口處用濕紙或濕棉花包裹保濕，再裝于合適大小的容器中，容器上扎些小孔通氣，樣品帶回實驗室后解開捆綁的枝梢插入水中，長期保存最好每２～３ ｄ換一次清水，枝梢保存２個月仍然鮮活。分別以不同品種的嫩葉、不同葉位的鮮葉以及在水中保存不同時間的枝梢上的葉片為材料，提取茶樹基因組ＤＮＡ。

１．２ ＣＴＡＢ法抽提茶樹基因組ＤＮＡ

①從枝梢上剪取少量茶樹鮮葉（０．５ ｃｍ２），加０．８ ｍＬ １．５×ＣＴＡＢ［１５ ｇ／Ｌ ＣＴＡＢ＋７５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ ８．０）＋１５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ＋６１．４ ｇ／Ｌ ＮａＣｌ］研磨成糊狀，裝入１．５ ｍＬ離心管中（若不馬上抽提可以放入－２０ ℃冰箱保存）；②放入６５ ℃水浴鍋中保溫１５ ｍｉｎ；③加入等體積的氯仿／異戊醇（體積比為２４∶１），放在搖床上輕搖１０ ｍｉｎ，再于１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ；④吸上清液到另一個新離心管中，加入２倍上清液體積的９５％乙醇，上下顛倒數(shù)次混勻后放入－２０ ℃冰箱沉淀ＤＮＡ １５ ｍｉｎ；⑤１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心５ｍｉｎ，棄上清液；⑥所得ＤＮＡ沉淀吹干后加３００ μＬ ｄｄＨ２Ｏ溶解，重復步驟③～⑤，以去除雜質(zhì)，提高ＤＮＡ提取質(zhì)量；⑦加１ ｍＬ ７０％乙醇上下顛倒數(shù)次，離心后倒出乙醇，吹干離心管，加入１００ μＬ ＴＥ或ｄｄＨ２Ｏ溶解，－２０ ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

１．３ 基因組ＤＮＡ電泳檢測

１％瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的茶樹基因組ＤＮＡ，１８０ Ｖ電泳３０ ｍｉｎ后ＥＢ染色，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照保存。

１．４ ＰＣＲ反應

ＰＣＲ反應體系為２０ μＬ，包括模板ＤＮＡ １ μＬ，１×ＰＣＲ Bｕｆｆｅｒ，２ ｍｍｏｌ/Ｌ ｄＮＴＰｓ １．５ μＬ，２５ ｍｍｏｌ/Ｌ ＭｇＣｌ２ １．２ μＬ，１０ μｍｏｌ／Ｌ引物１ μＬ， １ Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，加ｄｄＨ２Ｏ至２０ μＬ。所用引物為ＲＡＰＤ隨機引物，序列為５′-ＧＧＡＧＧＧＴＧＴＴ-３′。ＲＡＰＤ擴增程序為：９４ ℃預變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性３０ ｓ，３８ ℃退火５０ ｓ，７２ ℃延伸９０ ｓ，共３５個循環(huán)；７２ ℃延伸７ ｍｉｎ。ＰＣＲ產(chǎn)物檢測方法與基因組ＤＮＡ檢測相同。

２ 結(jié)果與分析

２．１ 以茶樹嫩芽為材料抽提ＤＮＡ

取保存的丹桂、鐵觀音茶樹枝梢頂芽為材料，用上述簡化的ＣＴＡＢ法抽提ＤＮＡ，瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示兩個樣品提取的ＤＮＡ條帶清晰、亮度均一（圖１）；ＰＣＲ擴增結(jié)果顯示ＲＡＰＤ隨機引物在兩個茶樹品種的基因組ＤＮＡ中均能得到條帶清晰的擴增產(chǎn)物（圖２），說明用該方法抽提的ＤＮＡ質(zhì)量較好，可以用于ＰＣＲ反應。

２．２ 不同葉位的鮮葉為材料抽提ＤＮＡ

以丹桂品種同一枝梢不同葉位的鮮葉為材料抽提ＤＮＡ，檢測不同成熟度葉片對ＤＮＡ抽提效果的影響。所用材料有頂芽、枝梢倒１葉、倒２葉、倒３葉、倒４葉。瓊脂糖凝膠電泳顯示５份材料抽提的ＤＮＡ都有清晰的主帶（圖３），ＰＣＲ擴增產(chǎn)物均有清晰且亮度均一的條帶（圖４），可見不同葉位鮮葉抽提的ＤＮＡ質(zhì)量差別不大，說明幼嫩組織和成熟葉片都可以用于抽提ＤＮＡ。

２．３ 保存不同天數(shù)的枝梢鮮葉為材料抽提ＤＮＡ

把茶樹枝梢插在水中，每２～３ ｄ換一次清水，可以在水中保存（生長）２個月仍然保持鮮活，分別以水中保存１、５、１０、２０ ｄ的丹桂枝條葉片為材料抽提ＤＮＡ，瓊脂糖凝膠電泳（圖５）和ＰＣＲ擴增（圖６）結(jié)果顯示從不同保存天數(shù)的葉片中提取的基因組ＤＮＡ質(zhì)量沒有明顯差異，均可用于ＰＣＲ反應。

３ 討論

３．１ 枝梢保鮮法可有效保存茶樹鮮葉

在野外采集茶樹樣品時，如何保存鮮樣是一個難題，使用冰塊或液氮低溫保存受到實驗條件和保存時間的限制，使用干燥保存又易增加后期提取的難度。本實驗采用枝梢保鮮法保存樣品，把枝梢切下后切口保濕處理，帶回實驗室插在水中保存（生長），每２～３ ｄ換一次清水，２個月葉片仍然鮮活，以保存２０ ｄ的枝條葉片為材料，提取的ＤＮＡ質(zhì)量仍較好，可用于后期ＰＣＲ擴增反應，可見該方法可用于野外采集樣品的保存。

３．２ 不同成熟度的茶樹葉片均可抽提出高質(zhì)量的ＤＮＡ

大多數(shù)的文獻報道［１2－１4］都偏向于用幼嫩芽葉為抽提ＤＮＡ的材料，可能是其含ＤＮＡ較多，但取樣往往受到季節(jié)和生長時期的限制，而且幼嫩芽葉容易枯死不易保存，本實驗以不同葉位的鮮葉為材料，提取到的ＤＮＡ質(zhì)量較高，可用于后續(xù)實驗，可見成熟葉也能抽提出高質(zhì)量的ＤＮＡ，這更方便茶樹ＤＮＡ樣品采集。

３．３ 簡化ＤＮＡ抽提步驟

已報道的茶樹ＤＮＡ抽提方法都很復雜，使用的試劑較多，步驟繁瑣，同時要求液氮研磨，或者在冰上操作，整個過程歷時長，工作量大。本實驗改良了ＣＴＡＢ提取法，實驗材料直接在室溫研磨，不需使用液氮或者在冰上操作，減少了添加提取液（由葡萄糖、ＰＶＰ、β－巰基乙醇配成）、飽和酚以及ＲＮａｓｅ Ａ、ＮａＡｃ等的步驟，所需時間縮短，提取效率高，并能獲得高質(zhì)量的ＤＮＡ。提取過程中對ＤＮＡ進行了一次純化，實際操作中也可以不純化，通過稀釋ＤＮＡ模板濃度減少雜質(zhì)對ＰＣＲ反應的影響。

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