載脂蛋白B\\載脂蛋白E及血管緊張素原基因多態(tài)性與冠心病的關(guān)系

[摘要] 目的 探討載脂蛋白B、E（ApoB、ApoE）基因及血管緊張素原基因（AGT）多態(tài)性與冠心病（CHD）的相關(guān)性。方法 采用基因芯片技術(shù)分析89例CHD患者和78例非CHD患者的ApoB Xba I、ApoE112/158及AGT M235T基因多態(tài)性及等位基因頻率。結(jié)果 CHD組ApoB Xba I、ApoE112/158及AGT M235T基因型分布與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。CHD組的ApoB Xba I的X+X+基因型及等位基因X+頻率顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），ApoE112/158的ε3/4、ε4/4基因型及等位基因ε4頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；CHD組AGT-TT基因型頻率及T等位基因頻率均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論ApoB Xba I、ApoE112/158和AGT M235T的基因多態(tài)性可能是中國人CHD的危險因素。ApoB Xba I等位基因X+；ApoE112/158的等位基因ε4和AGT M235T基因的T等位基因是CHD的重要遺傳標(biāo)記。

[關(guān)鍵詞]冠心病；載脂蛋白B；載脂蛋白E；血管緊張素原；基因；多態(tài)性

[中圖分類號] R541.4 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2011）19-04-03

The Research of Apolipoprtein B，E and Angiotensinogen Gene Polymorophisms in Predisposition to CHD

MA Juan ZHANG Hongqing WANG Wei TIAN Qing

Department of Cardiology，The First People’s Hospital of Kunming City，Kunmimg 650011，China

[Abstract] Objective To explore the relationship of apolipoprotein B，E（ApoB，ApoE）and angiotensinogen（AGT）gene polymorphism with coronary heart disease（CHD）. Methods Gene chip technology was performed to analyze ApoB XbaⅠ、ApoE 112/158 and angiotensinogen gene polymorphism. The allele frequency and gene type distribution were compared between groups. ResultsThere was a significant difference in the distributuion of Apo B，ApoE and AGT gene type between patients and controls（P＜0.05）. The frequency of X+X+ genetype and X+ allele of ApoB were significantly higher in patients with CHD than controls（P＜0.05）；the frequency ofε3/4、ε4/4 genetype andε4 allele of ApoE112/158 were higher in patients with CHD than controls（P＜0.05）. AGT-TT gene type was related with CHD significantly（P＝0.003）and T allele was more frequent significantly in CHD group than controlls（P＜0.05）. ConclusionThe Apo B，ApoE and AGT gene polymorphism may be the risk factors of CHD；X+ allele of ApoB Xba Ⅰ andε4 allele of ApoE gene and T allele of AGT gene might be the geneticmarkers of CHD.

[Key words] Coronary heart disease；Apolipoprotein B；Apolipoprotein E；Angiotensinogen；Gene；Polymorphism

冠心病（CHD）是嚴(yán)重危害人類健康的常見心血管疾病，病因是由遺傳因素和環(huán)境條件共同決定的，在CHD的發(fā)生和發(fā)展中，遺傳因素可能更為重要。近年來已相繼研究發(fā)現(xiàn)了一些與之相關(guān)致病或易感基因，其中包括血管緊張素原（AGT）、亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因、一氧化氮合酶（NOS）基因以及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因位點等，這些基因結(jié)構(gòu)和（或）表達異常可導(dǎo)致CHD，但各地報道不一，未見基因芯片聯(lián)合分析ApoB、ApoE及AGT基因多態(tài)性與CHD相關(guān)性的報道，本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)聯(lián)合檢測多個基因多態(tài)性及等位基因頻率，分析它們與CHD的相關(guān)性。

1#8195;資料與方法

1.1#8195;一般資料

選擇2005～2006年昆明市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科收住的CHD患者89例，符合缺血性心臟病（IHD）的命名和診斷標(biāo)準(zhǔn)，均為冠狀動脈造影證實冠狀動脈病變患者；其中男62例，女27例，平均年齡（60.01±12.40）歲。同期78名非CHD患者作為對照組，均行冠狀動脈造影術(shù)無冠脈病變；其中男44例，女34例，平均年齡（64.27±11.28）歲。兩組患者一般資料（平均總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、心臟超聲心動圖測平均左室舒張末徑、平均左室收縮末徑、左室射血分?jǐn)?shù)）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2方法

采用基因芯片檢測技術(shù)，結(jié)合PCR體外擴增方法，檢測人類冠心病相關(guān)基因ApoB Xba I、ApoE112/158、AGT M235T的多態(tài)性情況。

1.2.1標(biāo)本采集#8195;用一次性無菌注射針頭采集被檢者靜脈血0.5mL，收集于含50μL的2%EDTA溶液的1.5mL的無菌離心管中，蓋上管蓋，上下顛倒數(shù)次使混勻。

1.2.2#8195;存放#8195;上述血樣在2～8°C保存，保存期不應(yīng)超過3周；在-20°C保存期半年，-80°C可長期保存，但嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

1.2.3擴增#8195;采用適用0.2mL擴增管并有熱蓋的PCR擴增儀。

1.2.4#8195;雜交#8195;在芯片雜交過程中采用溫控精度為±0.5°C的恒溫設(shè)備（BaiO FLWS-526全自動雜交儀）進行雜交。

1.2.5#8195;識讀#8195;在芯片雜交信號檢測時采用BaiO BE-2.0生物芯片識讀儀識讀。圖像Array Docctor軟件分析可自動輸出檢測結(jié)果，最后檢測出ApoB Xba I、ApoE112/158及AGT M235T基因的多態(tài)性位點。

1.3#8195;質(zhì)量控制

在每次檢測中都應(yīng)設(shè)置陰性、陽性、對照品。產(chǎn)品檢測過程中，若軟件對“標(biāo)志列、陰性、陽性對照”三者進行判斷后，輸出其中之一為“不合格”，則實驗無效。

1.4#8195;結(jié)果判斷

由軟件自動判斷并輸出結(jié)果。當(dāng)軟件判斷標(biāo)志列、陰性、陽性對照均合格時，會自動輸出檢測結(jié)果。見表1。

1.5#8195;統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS11.0軟件包作統(tǒng)計學(xué)處理。ApoB Xba I、ApoE112/158及AGT M235T基因型和等位基因頻率之間的比較用χ2檢驗，同時計算優(yōu)勢比（OR）及95%可信區(qū)間（95%CI）。

2結(jié)果

2.1#8195;AGT M235T基因型及等位基因頻率的分布情況

CHD組以AGT-TT基因型最常見，對照組AGT-MT基因型最常見；CHD組AGT M235T基因型分布與對照組相比有明顯差異（P＜0.05），易感等位基因T頻率高于對照組（P=0.01，CI=0.339～0.864；OR=0.541），顯示AGT基因多態(tài)性與CHD發(fā)病存在關(guān)聯(lián)。見表2。

2.2#8195;ApoB Xba I基因型及等位基因頻率分布

CHD組及對照組ApoB Xba Ⅰ基因型均以X+X+型最常見，CHD組X+X+基因型明顯高于對照組，兩組基因型分布相比均有顯著差異（P＜0.05），CHD組等位基因X+頻率明顯高于對照組（P＜0.05，OR=3.46，CI=1.554～7.681）。顯示ApoB基因多態(tài)性與CHD發(fā)病存在密切關(guān)聯(lián)，等位基因X+與CHD發(fā)病正相關(guān)。見表3。

注：與對照組比較，*P＜0.05

2.3CHD組ApoE112/158 基因型及等位基因頻率分布等位基因頻率情況

CHD組ApoE112/158等位基因頻率：ε3＞ε4＞ε2；對照組ε3＞ε2＞ε4；CHD組以ε3/3型最常見，ε3/4型次之；對照組以ε3/3型最常見，ε2/3型次之兩組基因型分布相比均有顯著差異（P＜0.05）；冠心病組ε3/4、ε4/4基因型頻率明顯高于對照組（P＜0.05），ε4等位基因頻率明顯高于對照組（P＜0.05，OR=2.301，CI=1.203～4.398），兩組的ε3等位頻率沒有明顯差異，顯示ApoE基因多態(tài)性與CHD發(fā)病存在密切關(guān)聯(lián)，ε4等位基因與CHD發(fā)病正相關(guān)。見表4。

2.4#8195;AGT-TT， ApoE-ε4/4，ApoB- X+X+聯(lián)合基因型分布情況

在CHD組未發(fā)現(xiàn)AGT-TT、ApoE-ε4/4、ApoB-X+X+基因型聯(lián)合出現(xiàn)。

3#8195;討論

近年來由于研究手段的進步，人們對CHD的遺傳背景給予了更多的關(guān)注，其中AGT M235T多態(tài)性與冠心病的關(guān)系倍受重視。AGT-TT基因型可能通過協(xié)同效應(yīng)增加促血管緊張素Ⅱ的生成而增加了CHD的發(fā)病危險。1995年Katsuya等[1]進行AGT M235T多態(tài)性的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)AGT基因的T/T型頻率在CHD組為21.9%，顯著高于對照組的14.5%，AGT T/T型是CHD的獨立危險因素。梁茜等[2]研究發(fā)現(xiàn)AGT的基因多態(tài)性可能是中國老年人CHD的獨立危險因素。本研究也觀測到CHD組AGT M235T基因型分布與對照組相比有顯著差異，AGT-TT型及T等位基因頻率均明顯高于對照組，提示AGT M 235T多態(tài)性與CHD發(fā)病有關(guān)。

脂質(zhì)代謝紊亂是致動脈粥樣硬化（AS）及CHD發(fā)生的最重要的危險因素。目前發(fā)現(xiàn)ApoB基因cDNA第7673位核苷酸C-T突變，產(chǎn)生了一個XbaⅠ切點，即X+等位基因，它與脂質(zhì)代謝紊亂密切相關(guān)。Guzman等[3]研究發(fā)現(xiàn)在高血脂女性患者中ApoB XbaⅠ基因多態(tài)性與總膽固醇（TC）和低密度脂蛋白（LDLC）水平增高顯著相關(guān)。李莎等[4]研究發(fā)現(xiàn)具有冠心病家族背景的X+等位基因的個體顯著高于對照，而且相應(yīng)的TC、LDLC和ApoB100水平也明顯高于對照組，它們是漢族人群中冠心病發(fā)病的重要遺傳標(biāo)記。資料表明[5]（浙南地區(qū)）正常人組Apo B基因的多態(tài)Xba Ⅰ酶切位點以X-占優(yōu)勢，而CHD組XbaⅠ酶切位點以X+頻率為優(yōu)勢，和正常人組對比差別顯著。本研究結(jié)果示CHD組ApoB XbaⅠ基因型分布與對照組相比有明顯差異，CHD組X+X+基因型及等位基因X+頻率明顯高于對照組，與國內(nèi)報道一致，提示ApoB XbaⅠ的基因多態(tài)性是CHD遺傳危險因素，等位基因X+是CHD的重要遺傳標(biāo)記。

ApoE基因多態(tài)性是決定血脂水平進而影響動脈粥樣硬化病變發(fā)生發(fā)展的遺傳因素之一。不同的ApoE表型對CHD的易感性不同，研究表明有ε4等位基因CHD的發(fā)生頻率最高，而ε2等位基因可能由于有兩個游離的巰基，因此ε2者較少患CHD、頸動脈疾病或中風(fēng)，對心血管具有保護作用。Kolovougd等[6]通過大批量標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性并沒有性別的差異性。Banaresvg等[7]發(fā)現(xiàn)ApoEε4等位基因和冠心病有著很大的關(guān)聯(lián)，并且呈現(xiàn)年齡依賴性，是一個非常重要的遺傳因素。本文CHD組ε3/4、ε4/4基因型和ε4等位基因頻率明顯高于對照組，ε2等位基因頻率明顯低于對照組，顯示ε4等位基因與CHD發(fā)病存在密切關(guān)聯(lián)。兩組的ε3等位頻率沒有明顯差異。本研究結(jié)果和國內(nèi)外相關(guān)報道一致，支持ApoE等位基因多態(tài)性與冠心病之間存在關(guān)聯(lián)，提示ε4等位基因是動脈硬化發(fā)生的潛在因素，為冠心病的易患因子，而ε2等位基因?qū)跔顒用}粥樣硬化的發(fā)展可能有保護作用。

本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)，將中國人的AGT、ApoB、ApoE基因型探針固定于同一張基因芯片表面，利用堿基互補配對原理進行雜交，通過檢測探針分子雜交信號強度，在同組人群同時檢測多種CHD易感基因的多態(tài)性位點，其特點是高效、快速、自動微型化、高通量、高度并行性及高度敏感性，有著廣泛的應(yīng)用前景。對于多基因病包括，使用基因芯片技術(shù)進行基因多態(tài)性聯(lián)合分析比單一基因更有價值，將來可根據(jù)不同基因型進行個體化預(yù)防、治療和病情隨訪。

[參考文獻]

[1] Katsuya T，Koike G，Yee TW，et al. Association of angiotensinogen gene T235 variant with increased risk of coronary heart disease[J]. Lancet， 1995，345（8965）：1600-1603.

[2] 梁茜，董吁鋼，楊希立，等. 基因芯片技術(shù)分析老年冠心病患者的易感基因[J]. 中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2006，25（6）：420-423.

[3] Guzman EC，Hirata MH，Quintao EC，et al. Association of the apolipoprotein B gene polymorphisms with cholesterol levels and response to fluvastatin in Brazilian individual with high risk for coronary heart disease[J]. Clin Chem Lab Med，2000，38（8）：731-736.

[4] 李莎，雷兆文，陳子立，等.冠心病家族史青少年載脂蛋白E、B的基因多態(tài)性[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2003，20（3）：241-243.

[5] 譚應(yīng)霞，俞康，沈志堅，等. 浙南地區(qū)人群ApoB、ApoE等位基因頻率的初步研究[J].癌變、畸變、突變雜志，1998，11（2）：78-80.

[6] Kolovou GD，Anagnostopoulou KK，Mikhailidis DP，et al. Apolipoprotein E genotype in matched men and women with coronary heart disease[J]. Ann Clin Lab Sci，2005，35（4）：391-396.

[7] Banares VG，Peterson G，Aguilar D，et al. Association between the APOε4 allele and atherosclerosis is age dependent among Argentine[J]. Hum Biol， 2005，77（2）：247-256.

（收稿日期：2011-03-08）

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文