nm23-H1與NGAL在宮頸癌中的表達(dá)與臨床分析

[摘要] 目的 探討nm23-H1、NGAL在宮頸癌中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。方法 應(yīng)用免疫組化SABC法檢測100例宮頸癌中nm23-H1、NGAL的表達(dá)。結(jié)果 宮頸癌中nm23-H1、NGAL的陽性率分別為48%和61%。其中，nm23-H1在不同年齡分組、臨床分期和病例類型中陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；在有腫瘤轉(zhuǎn)移的標(biāo)本中陽性率為67.86%，低分化標(biāo)本中陽性率為76.19%，腫瘤直徑≥4cm標(biāo)本中陽性率表達(dá)率56.52%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。NGAL在不同臨床分期和不同腫瘤直徑組中陽性表達(dá)率無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；＞45歲組標(biāo)本中陽性率為70.49%，在鱗癌標(biāo)本中陽性率為70.00%，在發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的標(biāo)本中陽性率為82.14%，在中高分化標(biāo)本中陽性率為67.09%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 nm23-H1和NGAL的表達(dá)情況對宮頸癌的預(yù)后評估有一定的意義。

[關(guān)鍵詞] 宮頸腫瘤；基因表達(dá)；免疫組化

[中圖分類號] R737.33[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2010）19-01-03

Expression of nm23-H1 and NGAL Gene in Cervical Cancer

CHENG Xiaoyan1ZHENG Hongfeng1LV Weichao1SONG Yun2

1.Department of Obstetrics and Gynecology，The Sixth Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College The People's Hospital of Lishui City，Zhejiang Province，Lishui 323000，China；2.Department of Pathology，The Sixth Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College The People's Hospital of Lishui City，Zhejiang Province，Lishui 323000，China

[Abstract] Objective To investigate the expression of nm23-H1 and NGAL gene in cervical cancer and its effect on the development of the cervical cancer. Methods The expression of nm23-H1，NGAL gene in 100 cases cervical cancer were studied with SABC immunohistochemcal technique. Results In cervical cancer，the positive expression rate of nm23-H1 and NGAL were 48% and 61%. The positive expression rate of nm23-H1 have no differences in different age groups，clinical stage and type of cases（P＞0.05）. The positive expression rate of nm23-H1 in the tumor metastasis，poor differentiation and tumor diameter ≥ 4cm specimens are high positive expression rate，respectively，67.86%，76.19% and 56.52%，the difference in their respective groups was significant（P＜0.05）. There were no differences in positive expression rate in different clinical stages and different tumor size groups of NGAL（P＞0.05）. NGAL have more positive expression rate in ＞45-year-old group，squamous cell carcinoma，tumor metastasis，high differentiation and tumor diameter ≥4cm specimens，respectively，70.49%，70.00%，82.14% and 67.09%，the difference in their respective groups were significant（P＜0.05）. Conclusion The positive expression rate of nm23-H1 and NGAL in the prognosis of cervical cancer have a certain significance.

[Key words] Cervical carcinoma；Gene expression；Immunohistochemistry technique

宮頸癌是危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，是世界范圍內(nèi)女性僅次于乳腺癌的第二大常見惡性腫瘤，全世界每年有20多萬婦女死于該疾病。近30年以來世界范圍內(nèi)宮頸癌的發(fā)病率和死亡率均有明顯下降趨勢，但新發(fā)病例中，83%發(fā)生在發(fā)展中國家。許多不發(fā)達(dá)國家，宮頸癌仍是女性癌癥死亡的主要原因。盡管我國開展宮頸癌篩查工作后宮頸癌的發(fā)病率和死亡率明顯下降，但局部地區(qū)宮頸癌的發(fā)病率和死亡率仍有增長趨勢，而且部分地區(qū)還出現(xiàn)了宮頸癌患者年輕化趨勢。我國每年新發(fā)病例約有13萬，是世界宮頸癌新發(fā)病例的四分之一，位居我國女性惡性腫瘤首位。隨著宮頸癌篩查的普遍開展，早期診斷成為可能，宮頸癌的預(yù)后也較之以往有了很大改善，盡管如此，晚期腫瘤的復(fù)發(fā)率和死亡率依然較高，尤其是在具有高危因素的宮頸癌患者中，預(yù)后并不理想。諸多影響宮頸癌預(yù)后的因素中，首要的影響因素是腫瘤轉(zhuǎn)移。Noriaki Sakuragi[1]研究發(fā)現(xiàn)無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者5年生存率為82.2%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者5年生存率為64.0%～68.2%。與宮頸癌的發(fā)病機(jī)制相比，對其預(yù)后的相關(guān)因素的研究進(jìn)展相對緩慢。分子生物學(xué)的發(fā)展為我們從分子水平上揭示疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及對預(yù)后的影響提供了研究平臺。

20世紀(jì)90年代以來，nm23基因一直是醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)之一。其在腫瘤細(xì)胞增殖、分化和侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用[2]。目前己發(fā)現(xiàn)nm23基因中至少已有9種家族成員，nm23-H1是這些亞型中的典型代表。nm23-H1（Human nonmetastatic clone 23 type 1）通過影響其下游基因的表達(dá)，在不同腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能、復(fù)發(fā)和生存率等方面發(fā)揮著不同的作用。在成神經(jīng)細(xì)胞瘤和骨肉瘤中，當(dāng)nm23-H1表達(dá)減少時轉(zhuǎn)移潛能增加，相反，當(dāng)nm23-H1表達(dá)增加時患者的存活率大大下降[3，4]。目前關(guān)于nm23-H1在宮頸癌中的研究還較少，本研究通過研究nm23-H1及其下游基因NGAL（neutrophil gelatinase associated lipocalin；Lipocalin 2）在宮頸癌患者中的表達(dá)情況，分析其在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1#8195;資料與方法

1.1一般資料

本研究所用標(biāo)本為2008～2010年在本院行手術(shù)切除的宮頸癌組織。術(shù)前未經(jīng)放、化療，經(jīng)病理檢查均證實(shí)為宮頸癌，并由不同病理科醫(yī)師復(fù)合后分類。患者年齡23~68歲，按年齡分組≤45歲的患者39例，＞45歲的患者61例；宮頸鱗癌76例，腺癌24例；根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期：Ⅰ期62例，Ⅱ期38例。

1.2#8195;免疫組化

鼠抗人nm23-H1單克隆抗體、生物素化山羊抗小鼠IgG和SABC免疫組化試劑盒購自武漢博士德公司，鼠抗人NGAL多克隆抗體購自美國CST公司。標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，以5μm厚度切片。切片常規(guī)脫蠟、脫水，30％H2O2︰蒸餾水以1︰10的比例混合，室溫5min滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗3遍；將切片浸入0.01M枸櫞酸鹽（pH6.0），微波爐加熱至沸騰，間隔10min，反復(fù)兩次進(jìn)行熱修復(fù)抗原；滴加5％BSA封閉液，室溫20min；滴加一抗，室溫孵育2h；滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，室溫下30min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗三遍；滴加試劑SABC，室溫下20min，PBS洗3次每次5min；DAB顯色：取1mL蒸餾水，加試劑盒中A、B、C試劑各1滴，混勻后加至切片，室溫顯色20min；蘇木素輕度復(fù)染，自來水充分沖洗；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察。用已知陽性的肝細(xì)胞癌組織作陽性對照，用PBS液代替一抗作陰性對照。

1.3#8195;結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

以PBS代替一抗作為陰性對照，以試盒中所配的陽性切片為陽性對照，陽性表達(dá)為棕黃色顆粒。NGAL和nm23-H1主要位于細(xì)胞漿中，核呈弱陽性。采用雙盲法在高倍視野下（×400）每個切片角及中央取5個高倍視野隨機(jī)計數(shù)100個腫瘤細(xì)胞，各自計算100個癌細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占的比例，取平均值。根據(jù)染色程度及染色細(xì)胞百分率進(jìn)行評分：基本不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。著色細(xì)胞百分率＜5%為0分，6%~25%為1分，26%~50%為2分，＞50%為3分。兩項評分標(biāo)準(zhǔn)得分相乘為其最終結(jié)果判定值。0~1分陰性，≥2分為陽性。

1.4#8195; 統(tǒng)計學(xué)處理

運(yùn)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用χ2檢驗進(jìn)行差異統(tǒng)計學(xué)檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2#8195;結(jié)果

2.1#8195;基本資料

由于病例年齡分布較廣，將所選病例以45歲為界，分為≤45歲組和＞45歲組，兩組年齡分別為（43.81±13.23）歲和（51.27±11.29）歲，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在所有標(biāo)本中，nm23-H1在48%的標(biāo)本中呈陽性表達(dá)，而NGAL陽性表達(dá)率為61%。

2.2#8195;NGAL和nm23-H1與年齡和臨床分型的關(guān)系

由表1可知，nm23-H1無論是在不同年齡階段還是在不同病理類型中陽性率表達(dá)率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。而NGAL在＞45歲的患者中有較高的陽性表達(dá)率（70.49%），與≤45歲組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），在鱗癌中的陽性表達(dá)率也顯著高于腺癌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。而NGAL與nm23-H1在不同的臨床分期中陽性表達(dá)率均無差異。

2.3#8195; NGAL和nm23-H1與臨床病理特征的關(guān)系

NGAL與nm23-H1基因在低分化腫瘤中的陽性表達(dá)率比中、高分化中高，在發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤樣本中陽性表達(dá)率也較未發(fā)生轉(zhuǎn)移的標(biāo)本陽性表達(dá)率高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表2。

3#8195;討論

nm23基因是1988年Steeg等[5]用消減雜交法從鼠黑色素瘤細(xì)胞系分離出來的，nm23基因定位于染色體17q21.3，全長約8千個堿基，是一類結(jié)構(gòu)和功能相對保守的基因大家族，其成員均含有4~6個極為相似的折疊亞單位。該基因由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成，編碼的蛋白產(chǎn)物即二磷酸核苷激酶（NDPK），分子量約17KD。NDPK廣泛存在，能催化多種反應(yīng)，參與多種生物學(xué)活動，在細(xì)胞信號傳遞、細(xì)胞分化、維持細(xì)胞正常骨架等過程中，起著重要作用。它的兩條鏈通過隨機(jī)組合而形成等電點(diǎn)不同的系列同功酶，結(jié)構(gòu)的多態(tài)性決定了其功能的多樣性。NDPK改變還可引起染色體畸變，從而促使腫瘤轉(zhuǎn)移。NDPK被認(rèn)為至少參與兩個重要的生物學(xué)過程：一是參與微管蛋白的聚合與解體；二是G蛋白介導(dǎo)的信號傳遞。NDPK通過酶聯(lián)和高能磷酸鍵活化G蛋白，并以此方式調(diào)節(jié)大量G蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)反應(yīng)，進(jìn)而參與發(fā)育及腫瘤的發(fā)展，另外NDPK的轉(zhuǎn)磷酸作用產(chǎn)生的GTP能直接影響微絲、微管等細(xì)胞骨架蛋白的生物活動，通過參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)微管系統(tǒng)的狀態(tài)而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。

NGAL（neutrophil gelatinase associated lipocalin；Lipocalin 2）是最初從鼠腎細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的lipocalin家族成員之一，編碼25kDa分泌性蛋白，在人的嗜中性粒細(xì)胞中以25kDa單體或46kDa同型二聚體存在，或是以與金屬蛋白酶-9異源二聚體的形式存在。有研究證明NGAL蛋白除了存在于中性粒細(xì)胞之外，還在人體絕大多數(shù)正常組織中均有不同程度的表達(dá)。在肺泡細(xì)胞中NGAL的表達(dá)為陰性，而肺泡內(nèi)巨噬細(xì)胞中NGAL的表達(dá)為弱陽性，支氣管上皮中的產(chǎn)黏蛋白細(xì)胞則為強(qiáng)陽性表達(dá)。肝臟組織中僅僅是小葉內(nèi)肝膽管的局部陽性著色，而肝細(xì)胞為陰性。正常胰腺的腺泡與大導(dǎo)管為陰性，而小葉內(nèi)與小葉間導(dǎo)管局部為陽性表達(dá)。NGAL在女性生殖系統(tǒng)中的表達(dá)基本為陰性。正常的乳腺組織中導(dǎo)管上皮NGAL的表達(dá)為弱陽性，分泌乳汁的乳腺組織腺上皮細(xì)胞為中等陽性表達(dá)，而腺泡細(xì)胞和腺腔的大部分為陰性。隨著NGAL基因在小鼠和大鼠中的同源物24p3和NRL（neu-related lipocalin）相繼被證明是癌基因，近年來，對人類NGAL基因的研究已開始受到重視。研究發(fā)現(xiàn)NGAL蛋白在人類腫瘤中的表達(dá)模式具有明顯的細(xì)胞及組織器官特異性。

目前對nm23-H1和NGAL的研究已經(jīng)非常廣泛，它們對腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵潤有一定的影響，體外研究實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)當(dāng)NGAL高表達(dá)時能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，nm23-H1能抑制結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移。但nm23-H1和NGAL的表達(dá)與其對轉(zhuǎn)移潛能的影響并不是在所有腫瘤中都一樣，有時其功能甚至相反。例如nm23-H1在黑素瘤[6]、結(jié)腸癌[7]、胃癌[8]中抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，但在成神經(jīng)細(xì)胞瘤[9]中促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移；同樣NGAL在不同的腫瘤中發(fā)揮的作用也不盡相同，例如在胰腺癌[10]和卵巢癌[11]中抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，但在乳腺癌中卻促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[12]。這些研究結(jié)果的差異性表明nm23-H1和NGAL在各種腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，可能扮演不同的角色，其功能不能一概而論，對各類腫瘤應(yīng)該做獨(dú)立的研究。

本研究通過檢測不同組織中nm23-H1和NGAL的表達(dá)情況，結(jié)合臨床資料顯示nm23-H1陽性表達(dá)伴隨低分化、腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤體積較大的現(xiàn)象，提示在宮頸癌中促進(jìn)腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)移與Hsu等[13]的研究結(jié)果一致。NGAL在鱗癌和腺癌中陽性表達(dá)率有顯著差異，提示NGAL或許可以作為病理分型的檢測指標(biāo)。而在不同年齡組中NGAL的陽性表達(dá)率也有明顯的差異，這或許與基因表達(dá)的時空特異性有關(guān)。nm23-H1、NGAL在宮頸癌轉(zhuǎn)移中均高表達(dá)，提示它們在宮頸癌轉(zhuǎn)移中起著重要作用，這對宮頸癌患者的預(yù)后評估有重要作用。

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（收稿日期：2011-04-29）

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