脊髓損傷后髓磷脂抑制分子及作用機制的研究進展

[摘要] 脊髓損傷（SCI）常導致損傷平面以下運動、感覺以及括約肌永久性功能障礙。盡管國內外學者對此進行了不懈的探索，但是如何治愈SCI迄今仍是一全球性的醫學難題。脊髓損傷后軸突不能再生的主要原因包括髓磷脂相關抑制分子的存在、含抑制分子的膠質瘢痕形成、硫酸軟骨素蛋白多糖等。其中，髓磷脂相關神經生長抑制因子對中樞神經再生抑制起著關鍵作用，其相關抑制因子主要包括三種髓磷脂源性生長抑制蛋白： 髓磷脂相關糖蛋白、少突膠質細胞髓磷脂糖蛋白、Nogo-A。所有這些生長抑制因子都結合共同抑制蛋白受體—Nogo-66（NgR）受體復合體，激活遠端的Rho信號途徑。激活Rho與其下游的效應器蛋白-Rho蛋白激酶Ⅱ（ROCKⅡ）， 激活的ROCKⅡ作用于多種蛋白質底物而產生級聯瀑布信號傳遞， 調節生長錐內細胞骨架的重組，改變神經的生長方向，影響肌球蛋白的收縮等，引起軸突生長錐的回縮及塌陷，介導脊髓損傷后軸突的再生抑制。本文簡要綜述SCI后幾類髓磷脂相關抑制分子及其通過Rho-ROCKⅡ信號途徑傳遞及機制的研究進展。

[關鍵詞] 脊髓損傷；髓磷脂抑制分子； Rho-ROCKⅡ；

[中圖分類號] R651.2 [文獻標識碼] B[文章編號] 1673-9701（2011）19-25-03

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后，由于多種原因導致的軸突再生困難常引起永久性的神經功能缺損[1]，一直是治療難點。近年研究發現，SCI后修復困難的原因包括SCI后再生能力的下降、膠質瘢痕的屏障作用、神經營養因子的缺乏及髓鞘產生的軸突再生抑制因子等[2]。SCI后的軸突再生抑制分子大致可分為3類：髓磷脂相關抑制物、膠質瘢痕起源的抑制物、斥性軸突導向分子（repulsive axon guidance molecules，RGM）。本文主要針對SCI后髓磷脂相關抑制分子及其作用機制做一簡要綜述。

1#8195;髓磷脂相關抑制因子及其生物學特性

中樞神經系統內的髓鞘是由少突膠質細胞生成一種脂蛋白，包繞神經元軸突絕緣以保證電信號傳導并保護軸突。髓磷脂相關抑制因子已被證實是早期軸突再生失敗的主要原因。目前發現的抑制分子包括有Nogo-A、髓磷脂相關糖蛋白（myelin-associated glycoprotein，MAG）、少突膠質細胞髓磷脂糖蛋白（oligodendrocyte myelin glycoprotein，OMgp）等[3]。髓磷脂抑制因子在SCI后少突膠質細胞表達量明顯增加，與Nogo受體（Nogo receptor，NgR）及復合物結合后，引起神經元胞內骨架調節因子RhoA的活性改變， 導致神經元細胞生長錐崩解， 受損軸突的再生和延伸因而停止，從而發揮抑制神經再生的作用[4] 。

1.1#8195;Nogo-A結構、分布與生物學特性

研究人員2000年就成功克隆出了抑制軸突再生的Nogo基因。其由不同啟動子及剪切方式形成3個mRNA轉錄體，分別編碼為Nogo-A、B、C三種結構蛋白。Nogo-A抑制中樞神經再生的特性目前已明確，它具有抑制細胞黏附、遷移和軸突生長的特性，有很強的抑制軸突生長作用[5]。Nogo-A是一種主要由少突膠質細胞表達的跨膜糖蛋白，由1163個氨基酸組成，分子量約220kD，包含一個由1024個殘基組成的胞間結構域、7個N-糖基化位點、多個糖基化位點、2～3個跨膜結構域和一個短的胞內區。Oertle [6]認為Nogo-A有3個結構功能域：①Nogo-A的C端區域（Nogo-66），Nogo-66是羧基端兩個跨膜區之間的一個66個氨基酸形成的環狀結構，存在于內質網腔或細胞表面，能抑制中樞神經細胞軸突生長、誘導生長錐塌陷。②Nogo-A的N端，包括氨基端到第一個疏水區之間的片段，主要存在于胞外，能抑制神經纖維生長并對非神經細胞的伸展、遷移也起抑制作用，但表達量很少而對神經元影響甚微。③Nogo-A特有區域（NiG-△20）是Nogo-A中間存在的一個含有181個氨基酸的區域，可以限制成纖維細胞遷移，抑制軸突生長并誘導生長錐萎陷。Nogo-A主要在成體CNS少突膠質細胞中表達，表達位于髓鞘靠近軸突的內層膜，在少突膠質細胞分化和髓鞘形成過程中出現在細胞膜表面，最后以生長分叉包繞中樞系統白質，抑制其區域纖維生長，起到穩定神經元外纖維骨架來穩定神經系統功能的作用[7]。

1.2#8195;MAG結構、分布與生物學特性

MAG是免疫球蛋白超家族中一種跨膜蛋白質，分布在神經系統髓鞘中。MAG包括5個細胞外免疫球蛋白樣區域、1個跨膜區域和1個細胞內區域。MAG又稱siglec-4a（siglec是指免疫球蛋白超家族中唾液酸結合蛋白中的一個亞群）其抑制位點位于Ig5區[8]。MAG有L-MAG和S-MAG兩種異構體，主要由少突膠質細胞表達于軸旁周的膜上。MAG最突出特征是具有調節軸突雙向生長的能力， MAG分布于CNS中與軸突接觸髓鞘上，對發育中的神經元有促進作用，而對成熟神經元有抑制作用。Venkatesh[9]報道，MAG可同時綁定NgRl和NgR2，但與NgR2的結合有特異性，親和力高，故NgR2可能是MAG主要相關受體。MAG也缺乏胞內片段，主要通過信號轉導配體p75NtR結合NgR2來共同作用完成信號傳遞。

1.3#8195;OMgp結構、分布與生物學特性

OMgp是由440個氨基酸組成的糖基化磷脂酰肌醇錨定蛋白，通過糖磷脂酰肌醇（glycosyl phosphatidyl inositol，GPI）錨接于髓鞘外層， 主要表達在CNS的髓鞘、少突膠質細胞表面和外周神經節旁區。OMgp有四個結構域，包括氨基端較短富含半胱氨酸片段、富含亮氨酸重復序列、絲氨酸、蘇氨酸富含區和疏水羧基片段。2002年Wang及Kottis[10]等分別發現OMgp具有抑制軸突再生的作用。Habib檢測小鼠腦OMgp-mRNA及OMgp蛋白表達發現，出生時表達微弱，出生后逐漸升高分別于21、24d達最高峰后，略下降并穩定，P.Vourch等[11]檢測大鼠出生后額顳區、中央核、腦干、小腦等部位OMgp-mRNA的表達發現，出生后逐漸升高于42d達高峰后下降，于48d時穩定。發育過程中OMgp作用尚不清楚，根據其分布及損傷后抑制效應推測，可能作為一種正常環境因子參與軸突生長與聯系的調節，因此隨著發育時間的推移，神經元逐漸成熟，OMgp的表達也相應逐漸下降。實驗證實OMgp可與受體NgR結合抑制神經元軸突再生且與劑量相關。

2#8195;NgR分子結構與生物學特性

NgR作為三種髓鞘抑制蛋白共同受體，在軸突再生抑制信號傳導通路中起樞紐作用。NgR是由473個氨基酸殘基組成的GPI錨定蛋白，從N端至C端包含1個信號肽、8個亮氨酸重復序列（LRRs）、富含半胱氨酸型C端延伸區（LRRCT）、特異性C末端以及1個GPI結構，其中C羧基端通過糖基磷脂酰肌醇（GPI）定位于胞膜。而LRRNT/LRRs/LRRCT為NgR的配體結合域（LBD）。胚胎神經元中NgR并不表達也不敏感，而出生后廣泛存在于CNS多種細胞，密集分布于細胞質和細胞膜以及神經突起內，而且延伸至生長錐內C區和P區（以P區密度最高），被認為是Nogo-66作用的始動，同時NgR也是MAG和OMgp的功能受體，因此NgR成為CNS髓磷脂中軸突抑制性因子共同發揮作用的靶點[12]。

研究[13]發現，NgR不僅在大腦皮層、海馬、腦橋、小腦蒲肯野等細胞中存在，在少突膠質細胞，甚至在心、腎臟等外周組織也有分布與表達。NgR的分子序列中沒有跨膜成分，NgR借助于C端的一個糖基化磷酸肌醇（GPI）結構附著于神經元胞膜表面，通過與GPI錨著點錨定糖基化后，被特異的磷脂酶磷脂酰肌醇化后通過胞質膜釋放，在膜上存在的其他受體亞單位將細胞生長抑制信號向胞質內傳導后，Nogo-66與NgR通過特異的結合，產生軸突生長的抑制作用。受體亞單位有神經營養因子（N1F）受體p75NTR （p75neurotrophin receptor）和TROY兩種，p75NTR是一種單鏈跨膜糖蛋白，由1個信號肽、4個半胱氨酸富集區的胞外域、疏水的穿膜區以及1個富含堿性氨基酸的胞內域組成。其胞質部分與Rho作用，與NgR形成的復合物能將胞外抑制信號跨膜傳入靶神經元胞內；此外p75NTR-NgR復合物中尚有一種新的跨膜蛋白成分LINGO-1，由614個氨基酸殘基組成，胞外段具有LRR和IgC2兩個結構域，有一個跨膜結構域和一個較短的胞質區，另一種受體亞單位TROY是TNR超家族成員，其作為p75N1R代替物在其缺乏部位選擇性表達，與NgR和LINGO-1形成受體復合體，完成髓磷脂抑制因子的信號傳遞從而抑制軸突再生。

3#8195;Rho及RhoA分布與生物學特性

Rho是一種結合在胞膜內壁的鳥苷三磷酸酶（guanosine triphosphate，GTP）。RhoA在少突神經膠質細胞和軸突均可表達，而大腦白質的膠質細胞散布有RhoB；SCI后被Rho激活，第1天RhoA表達開始增加，第3天達最大，維持到第7天后逐漸下降。而Rho-GTP激酶是一個大家族，在人類包含21不同基因，至少有23種信號蛋白，其中最有特征的家族成員是RhoA、Rac1和Cdc42，彼此屬于不同亞群、亞家族。Rho-GTP激酶兩種構象（GDP滅活態與GTP激活態）是發揮RhoA作用的關鍵。髓磷脂相關抑制因子促進p75NTR與Rho-GDI的結合后，在鳥苷酸交換因子的作用下，形成Rho-GTP [14]，再由Rho介導激活其下游的效應器，進而誘導肌動蛋白聚合，最后導致生長錐的塌陷和軸突生長的抑制。

4#8195;髓磷脂抑制分子引起生長錐塌陷的信號傳遞及機制

上述幾類髓鞘相關的抑制分子與NgR特異性結合后通過：（1）與低親和力的神經營養因子跨膜受體P75NTR結合形成P75NTR-NgR復合物[15]。（2）跨膜糖蛋白LINGO-1與NgR或與P75 NTR /NgR結合，形成NgR/LINGO-1、P75NTR /NgR/ LINGO-11復合物[16]。（3）在不表達P75NTR神經元中，孤兒受體TROY與NgR及LINGO-1結合形成受體復合物[17]，傳遞胞外抑制信號至質膜內，作用于GTP酶-Rho[18]，它在Rho鳥苷酸交換因子（GEFs）作用下與三磷酸腺苷（ATP）結合而激活。激活Rho與其下游的效應器蛋白-Rho蛋白激酶Ⅱ（Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase Ⅱ，ROCKⅡ）的Rho結合結構域相結合后，自身抑制環打開，ROCKⅡ與ATP結合而磷酸化，激活的ROCKⅡ作用于多種蛋白質底物而產生級聯瀑布信號傳遞[19]，包括：（1） 使其底物肌球蛋白輕鏈 （myosin light chain，MLC） 第19位絲氨酸殘基磷酸化，Ⅱ型肌球蛋白被磷酸化后，使肌動蛋白活化ATP酶的活性增加，水解肌球蛋白ATP，使生長錐內的肌球蛋白和肌動蛋白絲收縮，從而將肌動蛋白絲向生長錐中心牽拉，其方向與軸突生長方向相反，導致生長錐回縮[19]；（2） 使肌球蛋白輕鏈磷酸酶（myosin light chain Phosphatase，MLCP）去磷酸化，從而調節生長錐內MLC的數量來影響軸突及生長錐[19，20]；（3）肌球蛋白輕鏈激酶1（myosin light chain kinase1，MLCK1）第508位蘇氨酸和肌球蛋白輕鏈激酶2（myosin light chain kinase 2， MLCK2）第505位蘇氨酸磷酸化，使絲切蛋白（cofilin）調節的肌動蛋白絲解聚，使軸突生長錐處于被抑制狀態[18-21]；（4）崩潰反應介質蛋白2（collapsing response mediator protein，CRMP-2）第555位蘇氨酸殘基磷酸化，抑制CRMP-2與微管異二聚體的連接并影響微管的動態平衡，從而抑制微管的組裝[21]；（5）微管結合蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP2）第1796位絲氨酸殘基，同時使微管結合蛋白第245位、377位蘇氨酸，第262位、409位絲氨酸殘基磷酸化，影響微管的平衡及神經元黏附分子的胞飲作用，使微管的解聚[22]；（6）使ERM（ezrin/radixin/moesin）蛋白質復合體及其他細胞骨架調節蛋白，如波形蛋白（vimentin）、膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）和神經纖維絲 （neurofilaments） 磷酸化，導致肌動蛋白解聚，生長錐塌陷[20]。通過以上方式調節生長錐內細胞骨架的重組，改變神經的生長方向，影響肌球蛋白的收縮等抑制軸突再生分子再生，引起軸突生長錐的回縮及塌陷。

5#8195;結語

綜上，髓磷脂相關抑制因子是抑制中樞神經系統軸突再生的一個關鍵因素，Nogo受體（NgR）是三種髓磷脂相關軸突生長抑制蛋白的共同作用點。在Rho途徑中，ROCKⅡ的活化與否對髓鞘中的抑制分子級聯的瀑布信號傳遞起著關鍵作用。目前大鼠脊髓損傷后局部應用C3轉移酶（Rho抑制劑）、局部或鞘內注射Y26732（ROCKⅡ選擇性阻斷劑）、腹腔內注射Fasudil（非選擇性的蛋白激酶抑制劑）等實驗證明，阻斷Rho-ROCKⅡ信號傳導途徑，具有神經保護、抑制凋亡、減少膠質瘢痕、促進軸突再生與功能恢復作用，但治療效果無特異性且療效不明顯，在人體實驗療效和副作用均無結果。盡管如此，但隨著SCI后Nogo影響軸突再生機制和Rho-ROCKⅡ、細胞極性信號傳遞途徑等機制的闡明及SCI后動物模型治療的資料積累，相信在不久的將來會取得新的進展。

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（收稿日期：2011-03-28）