抗原修復(fù)技術(shù)與卵巢癌腫瘤標(biāo)志物免疫組化染色結(jié)果分析

[摘要] 目的 了解抗原修復(fù)對免疫組化染色結(jié)果的影響，分析抗原修復(fù)后免疫組化染色P53蛋白和CA-125陽性率的關(guān)系。方法 卵巢癌標(biāo)本93例，其中漿液性腺癌47例，黏液性腺癌39例。子宮內(nèi)膜樣癌5例，未分化癌2例，采用高溫高壓法進(jìn)行抗原修復(fù)，免疫組化Envision法染色檢測P53蛋白和CA-125的表達(dá)。結(jié)果 抗原修復(fù)后切片背景干凈，顯色對比鮮明，結(jié)構(gòu)清晰，定位準(zhǔn)確，易于觀察，P53蛋白陽性率（66.7% 比 48.4%）和CA-125陽性率（58.1%比40.0%）均高于未修復(fù)組，有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)論 抗原修復(fù)技術(shù)對提高卵巢癌免疫組化染色質(zhì)量有一定提高。

[關(guān)鍵詞] 卵巢癌；免疫組織化學(xué)；抗原修復(fù)；病理診斷

[中圖分類號]R737.31 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號]1673-9701（2011）19-93-02

卵巢腫瘤是女性生殖器常見腫瘤，卵巢癌病死率居?jì)D科惡性腫瘤之首。隨著免疫組化技術(shù)在腫瘤病理診斷中的不斷深入和廣泛應(yīng)用， 卵巢腫瘤特異性抗原或者基因的檢測日趨成熟，對卵巢腫瘤的病理分型和預(yù)后的判斷越來越有意義[1，2]。但是由于組織定會(huì)引起蛋白內(nèi)和蛋白間的亞甲基橋的橋連，引起許多抗原決定簇被封閉，影響了免疫組化的結(jié)果。本研究通過高溫高壓處理法進(jìn)行抗原修復(fù)、免疫組化技術(shù)檢測卵巢上皮腫瘤組織中P53蛋白、CA-125，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1 標(biāo)本來源

卵巢癌標(biāo)本93例，均來自我院2006年1月～2010年12月住院的卵巢腫瘤患者，年齡18～74歲，平均52.3歲。術(shù)前無放療及化療史，經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為上皮性卵巢癌。其中漿液性腺癌47例，黏液性腺癌39例。子宮內(nèi)膜樣癌5例，未分化癌2例。

1.2組織來源

所有組織來源于我院病理科，經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為卵巢上皮性惡性腫瘤。標(biāo)本固定于中性福爾馬林中，4 ℃下24h常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片。切片厚4μm。每例均切6張，附貼于涂有多聚-L-賴氨酸的玻片上，置60℃烤箱內(nèi)烘烤。將每個(gè)病例的6張切片隨機(jī)分為兩組，組1為不修復(fù)組，組2為抗原修復(fù)組。

1.3抗原修復(fù)方法

組1不進(jìn)行抗原修復(fù)，直接進(jìn)行免疫組化染色；組2采用高溫高壓法進(jìn)行抗原修復(fù)，市售家用壓力鍋，工作壓力為90 kPa。石蠟切片脫蠟至水。PBS浸泡3次，每次2min。將修復(fù)液0.01mmol檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）燒開后將切片放入高壓鍋中，然后蓋好蓋子，加上氣壓閥，繼續(xù)加熱至噴汽時(shí)，即達(dá)到工作溫度和工作壓力，開始計(jì)時(shí)2min后壓力鍋離開熱源，自然冷卻。

1.4免疫組化染色

免疫組化Envision法染色檢測P53蛋白和CA-125的表達(dá)。所使用試劑P53蛋白單克隆抗體、CA-125及Envision試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，按其使用說明書操作。用已知P53陽性的鼻咽癌切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。組1石蠟切片脫蠟至水。組2切片自然冷卻后，3%H2O2室溫孵育5～10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；蒸餾水沖洗2次，PBS浸泡3次，每次2 min；滴加一抗工作液，37 ℃孵育2 h或4 ℃過夜；PBS沖洗3次，每次2 min；滴加適當(dāng)量的二抗，37 ℃孵育 0.5 h；PBS沖洗3次，每次2 min；DAB顯色；自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。

1.5陽性結(jié)果

判斷標(biāo)準(zhǔn)P53蛋白陽性細(xì)胞核內(nèi)有棕色顆粒狀物質(zhì)、CA-125陽性細(xì)胞膜染成棕黃色為陽性。根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例分為4級：0％為陰性（-），1%～10％為弱陽性（+），11%～50％為中等陽性（++），＞50%為強(qiáng)陽性（+++）。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

兩組率的比較采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

抗原修復(fù)后切片背景干凈，顯色對比鮮明，結(jié)構(gòu)清晰，定位準(zhǔn)確，易于觀察；P53蛋白陽性率和CA-125陽性率均高于未修復(fù)組，詳見表1。

3 討論

免疫組化是免疫組織化學(xué)技術(shù)的簡稱，它是應(yīng)用抗原、抗體特異性結(jié)合的原理，使用已知的抗體在病理切片上與相應(yīng)的抗原結(jié)合，然后把結(jié)合產(chǎn)物應(yīng)用組織化學(xué)的方法顯現(xiàn)出來，使之可以在顯微鏡下觀察得以確認(rèn)；是免疫學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)和病理形態(tài)結(jié)合的一門新興學(xué)科，具有操作簡單、敏感性高、特異性強(qiáng)及將形態(tài)、代謝和機(jī)能密切結(jié)合起來等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于病理診斷、鑒別診斷[3]。但經(jīng)10%中性福爾馬林固定石蠟包埋的切片，組織中的許多抗原決定簇被醛基交聯(lián)封閉，以至于無法與抗體結(jié)合，從而影響染色結(jié)果。并且固定時(shí)間越長的標(biāo)本，它所形成的交聯(lián)就越緊密，抗原就越難以被激活，所需的修復(fù)強(qiáng)度也就越強(qiáng)。因此組織中抗原性修復(fù)技術(shù)與免疫組織化學(xué)染色的成敗有十分密切的關(guān)系[4]。CA-125和P53是常用的卵巢腫瘤標(biāo)志物，與腫瘤大小、病理類型、分化程度、病人的預(yù)后、術(shù)后易復(fù)發(fā)等指標(biāo)密切相關(guān)[5]，因此準(zhǔn)確進(jìn)行免疫組化染色檢查對臨床工作意義重大。本文應(yīng)用高溫高壓法對93例卵巢癌組織切片分別進(jìn)行抗原修復(fù)，發(fā)現(xiàn)修復(fù)后切片背景干凈，顯色對比鮮明，結(jié)構(gòu)清晰，定位準(zhǔn)確，易于觀察，方法穩(wěn)定，結(jié)果可靠，可提高病理診斷的準(zhǔn)確性。

1991年 “甲醛對蛋白的改建可以在高溫120℃及酸堿作用下復(fù)原”，這一重要線索成功地創(chuàng)造了抗原修復(fù)技術(shù)，該技術(shù)被譽(yù)為“免疫組化染色的一次革命”，迅速在世界范圍內(nèi)推廣。抗原熱修復(fù)的原因和理論基礎(chǔ)是通過加熱水解被醛基交聯(lián)封閉的許多抗原決定簇，使抗原決定簇被激活，其中修復(fù)的溫度和時(shí)間非常重要。高壓鍋進(jìn)行高溫高壓修復(fù)可以避免外界環(huán)境改變所致溫度的影響，高壓修復(fù)溫度均一，節(jié)省時(shí)間。高壓抗原修復(fù)法在染色強(qiáng)度和重復(fù)性等方面優(yōu)于微波法[6]，是細(xì)胞核陽性的抗體。P53蛋白在細(xì)胞核表達(dá)，本文顯示高溫高壓修復(fù)后P53在卵巢癌細(xì)胞核的表達(dá)水平提高，同時(shí)主要在細(xì)胞膜表達(dá)的CA-125的陽性率也提高了。因此針對卵巢癌P53和CA-125免疫組化染色，高壓鍋修復(fù)可以提高陽性表達(dá)率，染色清晰，操作簡單，結(jié)果易于判斷。

有報(bào)道用檸檬酸緩沖液（pH6.0）、EDTA緩沖液（pH9.0）及高壓加熱法，胰蛋白酶消化對CD68、lysozyme、α-AT和S-100不同的抗體進(jìn)行修復(fù)，結(jié)果3種抗原修復(fù)法的免疫組化切片，胰蛋白酶修復(fù)法陽性率顯著高于高壓加熱法與微波加熱法且染色背景清晰，高壓加熱法與微波加熱法非特異性著色較深，陽性率低[7]。抗原修復(fù)雖然可以提高免疫組化陽性率，但是修復(fù)的方法較多，包括酶修復(fù)、熱修復(fù)等，不同組織類型、不同固定方法對抗原的修復(fù)應(yīng)答亦有所差異，因此對不同的抗體建議選用不同的修復(fù)方法可提高表達(dá)率，提高病理診斷的準(zhǔn)確性。

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（收稿日期：2011-02-25）

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