新城疫病毒作用下卵巢癌裸鼠移植瘤Survivin、Caspase-3的表達

[摘要] 目的 研究新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）對卵巢癌裸鼠移植瘤Survivin、Caspase-3表達的影響。方法 ①細胞培養：人卵巢癌細胞SKOV-3細胞的培養；②建立裸鼠移植瘤模型；③實驗分組：分為實驗組與對照組，實驗組為腫瘤內注射NDV病毒抗卵巢癌； ④應用免疫組化SP法觀察Survivin、Caspase-3的表達。結果 Survivin表達實驗組與對照組均為陽性，實驗組明顯弱于對照組，差異有顯著性（P＜0.05） ；Caspase-3表達實驗組均為陽性，對照組1例表達，實驗組明顯強于對照組，差異有顯著性（P＜0.05）。結論NDV可誘導腫瘤細胞凋亡，抑制其生長；其機制可能通過激活Caspase-3凋亡，抑制Survivin抗調亡作用。

[關鍵詞]卵巢癌；NDV；裸鼠移植瘤；免疫組化

[中圖分類號] R737.31 [文獻標識碼] A [文章編號]1673-9701（2011） 24-06-02

The Expression of Survivin and Caspase-3 in the Ovarian Cancer Nude Mice Transplanted Tumor by Newcastle Disease Virus

SU Lirong

Department of Obstetrics and Gynecology，Beijing Municipal Shunyi District Health Care Hospital for Women and Children， Beijing 101300， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of Survivin and Caspase-3 in the ovarian cancer nude mice injected by Newcastle disease virus. Methods SKOV-3 tumor cells were cultured；the model of SKOV-3 transplanted tumor model in the nude mice were established. We injected the NDV into the transplanted tumor in experiment group，water was injected in control group；Immunohistochemistry SP was used to detect the expression of Survivin and Caspase-3. Results The expression of Survivin was positive in both A and B group and the stain result in group A was lighter than in group B（P＜0.05）. The expressions of Caspase-3 were all positive in experiment group，only had one in control group and experiment group was inferior than control group（P＜0.05）.Conclusion When NDV is injected into，apoptosis is induced and the growth of neoplastic cell is inhibited. The mechanisms may be through activation of Caspase-3 and inhibition of anti-apoptosis effect of Survivin.

[Key words] Ovarian cancer；NDV；Transplanted tumor in nude mice；Immunohistochemistry

卵巢惡性腫瘤嚴重威脅婦科腫瘤患者生命，生物治療作為腫瘤治療的模式日益受到重視。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）是近年引起重視的一種病毒，有一定抑瘤作用。腫瘤的發生發展與細胞凋亡異常關系密切，凋亡的調控中凋亡抑制蛋白起重要作用。凋亡抑制蛋白Survivin通過抑制凋亡蛋白Caspase-3的活化或抑制己活化的蛋白酶活性發揮作用。Caspase-3是細胞凋亡調控中的關鍵蛋白酶，Survivin的抑制凋亡功能最強。

本實驗研究NDV對卵巢癌裸鼠移植瘤細胞Survivin、Caspase-3表達的影響，進一步證實NDV可誘導腫瘤細胞凋亡，抑制其生長，其機制可能通過激活Caspase-3凋亡，抑制Survivin抗調亡作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 腫瘤細胞 卵巢癌細胞由哈爾濱市腫瘤醫院細胞生物所提供。

1.1.2 動物 6周齡裸鼠22只，雌雄各半，16~18g，由北京動物中心提供。

1.2 試劑

新城疫病毒（NDV-D90）；胎牛血清；PBS磷酸鹽緩沖液；RPMI-1640培養液 （GIBCO公司）；青霉素、鏈霉素；胰酶；其他試劑由實驗室提供。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 細胞株呈貼壁生長，用含10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養液及在CO2體積分數為5%的37℃恒溫箱中、于飽和濕度下進行培養。用胰酶使貼壁細胞成為細胞懸液，離心得到細胞沉淀，再加培養液10mL成重懸細胞，取0.5mL懸液進行活細胞計數，反復計數3次，實驗中計數細胞總量，生理鹽水洗滌2次，將細胞調為5×107/mL。

1.3.2 病毒培養與純化 病毒保存液接種于雞胚，37℃培養72h，擴增病毒。培養結束后，將接種的雞胚放入4℃冰箱冷凍過夜。PBS調整NDV病毒密度為1×107pfu/mL，病毒分裝凍存備用。

1.3.3 裸鼠卵巢癌模型的構建 裸鼠飼養在恒溫（25℃～27℃）、恒濕（45%～50%）、無特殊病原菌（specific pathogen free，SPF）的條件，實驗過程無菌，用一次性無菌注射器抽取SKOV-3細胞懸液約0.2mL注入實驗裸鼠左側腋部皮下，每只鼠設1個皮下接種點，每點接種0.2mL細胞懸液，約含1×107個腫瘤細胞。注射后7d左右，在小鼠左側腋下長出大小一致腫瘤，即造模成功。

1.3.4 分組及病理觀察 皮下接種腫瘤細胞7d建模成功后把裸鼠隨機分成兩組，每組均為8只（NDV組、對照組）。NDV組：瘤內注射NDV 0.3mL/只（病毒數約1×106pfu）；對照組：瘤內注射PBS 0.3mL/只；切取小塊瘤組織標本，常規HE染色；免疫組化SP法。

1.4 結果判定

陽性細胞呈棕黃色著色，細胞著色強度分級：以多數陽性細胞呈現的顏色進行分類： 顯色強度與背景無明顯差別為陰性；顯色程度為淡黃色或個別細胞呈黃至棕黃色為弱陽性（+），記1分；棕黃色中度陽性（++），記2分； 細胞呈棕黃色染色為強陽性（+++），記3分。陽性細胞百分數記分和細胞著色強度記分相加即為最終積分。

1.5 統計學處理

采用SPSS14.0統計軟件進行數據處理。NDV對卵巢癌裸鼠移植瘤Survivin、Caspase-3表達的影響采用秩和檢驗分析，P ＜0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 HE染色

實驗組：癌細胞旁有凋亡細胞，體積縮小，核固縮。對照組： 細胞核大，不規則，染色質濃縮，形態多樣，有20%的壞死區。

2.2 免疫組織化學

2.2.1 皮下移植瘤Caspase-3表達 Caspase-3陽性染色主要位于細胞漿，呈棕黃色。NDV組均陽性表達，對照組Caspase-3只有1例表達，且NDV組棕黃染色明顯強于對照組，兩組差異有顯著性（P＜0.05）。見圖1、表1。

2.1.2 皮下移植瘤Survivin表達 Survivin陽性染色主要定位于細胞漿，也可見細胞核著色呈棕黃色，NDV組與對照組Survivin均為陽性表達，NDV組棕黃染色明顯弱于對照組，差異有顯著性（P＜0.05）。見圖2、3及表2。

3 討論

新城疫病毒 （NDV） 為不分節段的單股負鏈RNA 病毒[1]，關于NDV 治療腫瘤的機制，Siba等[2]研究發現，新城疫病毒介導溶瘤的機制既包括內源通路也包括外源通路。2007年García-Sastre等[3]首次報道了應用重組NDV 病毒進行癌癥治療的研究。本實驗確定新城疫病毒抗腫瘤作用，NDV對荷瘤裸鼠卵巢癌細胞Survivin、Caspase-3表達的影響，研究其對卵巢癌細胞的生長抑制作用。結果表明NDV 對卵巢癌細胞有抑制作用，NDV具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用，與國外文獻報道相符合[4]。

Caspase-3是Caspase家族核心蛋白酶，是凋亡關鍵酶。大多數細胞凋亡依賴于Caspase-3。當Caspase的活性受抑制引起細胞凋亡與增殖動態平衡失調，就引起多種腫瘤的發生、發展。NDV誘導腫瘤細胞凋亡是Caspase-3依賴的凋亡途徑殺傷腫瘤細胞。實驗HE染色光鏡下見大量壞死區，癌細胞周邊見凋亡細胞，細胞縮小、變圓，細胞核染色質致密、固縮，聚集于核膜下，說明NDV 可有效抑制腫瘤細胞生長。免疫組化Caspase-3在鼠移植瘤內幾乎呈陰性表達，NDV注射后Caspase-3明顯呈陽性表達，提示NDV誘導細胞凋亡與Caspase-3的激活明顯相關。NDV能夠明顯促進細胞凋亡抑制瘤細胞生長，有明顯抑瘤作用。細胞凋亡（apoptosis） 是控制細胞生存與死亡的關鍵機制。Survivin 是凋亡抑制蛋白（IAP） 家族成員之一。Survivin陽性染色主要定位于細胞漿，也可見細胞核著色，呈棕黃色。研究表明Survivin可通過多種調控機制發揮其強大的抗凋亡作用、促進細胞增殖；Survivin抗凋亡機制之一是通過抑制Caspase-3活性發揮抗凋亡作用。Survivin與Caspase-3結合抑制Caspases 的活性， 阻斷細胞的凋亡過程，促進腫瘤細胞增生。

本實驗證實卵巢癌皮下移植瘤Survivin表達為強陽性，而注射NDV組棕黃染色明顯弱于注射生理鹽水組，表明Survivin可能阻斷細胞凋亡過程，促進了卵巢癌細胞不斷增殖；Survivin可能直接作用于Caspase-3并抑制其活性，導致腫瘤細胞凋亡減少而抑制凋亡作用增強，腫瘤細胞過度增生。注射NDV后Caspase-3表達增加而Survivin表達減弱，提示NDV誘導的細胞凋亡可能激活Caspase-3的凋亡活性而抑制Survivin的抗凋亡過程。本實驗NDV瘤內注射誘導凋亡抑制瘤細胞生長，調動機體抗腫瘤的免疫功能，NDV為治療卵巢癌提供新思路。

NDV通過激活Caspase-3凋亡作用，抑制Survivin抗調亡，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制其生長。新城疫病毒（NDV）有可能成為卵巢癌生物治療的有效藥物，Survivin、Caspase-3可能成為療效指標之一。

[參考文獻]

[1] Mayo MA. A summary of taxonomic changes recently approved by ICTV[J]. Arch Virol， 2002， 147（8）： 1655-1663.

[2] Subbiah E， Daniel R， Siba KS， et al. Newcastle Disease Virus exerts oncolysis by both intrinsic and extrinsic caspase-dependent pathways of cell death[J]. J Virol， 2006，80（15）： 7522–7534.

[3] Vigil A， Park MS， García-Sastre A， et al. Use of reverse genetics to enhance the oncolytic properties of Newcastle disease virus[J]. Cancer Res， 2007， 67（17）： 8285–8292.

[4]盧圣棟. 現代分子生物學實驗技術[M]. 第 2 版.北京：高等教育出版社， 2001： 111-114.

（收稿日期：2010-08-18）