胎盤生長因子在乙肝肝硬化組織中的表達及意義探討

[摘要] 目的 研究胎盤生長因子（PLGF）在乙肝肝硬化組織中的表達及其意義。方法 對乙肝肝硬化終末期行肝移植術的切除肝10例和肝移植供體肝組織8例用RT-PCR和免疫組化方法檢測PLGF mRNA及蛋白的表達。結果 PLGF mRNA和蛋白在肝硬化組織中有表達，均明顯高于正常肝組織中的表達水平，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）。結論 PLGF在乙肝肝硬化組織中表達增加，不僅參與其中的炎癥過程，并且可能在肝硬化向肝癌發展的過程中起重要作用。

[關鍵詞] 乙型病毒性肝炎；肝硬化；胎盤生長因子

[中圖分類號] R575.2 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2011）24-76-02

Expression and Significance of Placenta Growth Factor in Tissue of Hepatic Cirrhosis after Viral Hepatitis Type B

LIN Shengdi1 CHEN Weilai2 PAN Chenwei3 LIN Wei3 TAO Chonglin4

1.Department of Intensive Care Unit， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou 325027， China； 2.Department of Neurology， the Third People's Hospital of Wenzhou， Wenzhou 325000， China； 3.Department of Infectious Disease， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou 325027， China； 4.Department of Hepatobiliary Surgery， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To investigate expression of placenta growth factor（PLGF）in the tissue of hepatic cirrhosis after viral hepatitis type B， and to explore the clinical significance of PLGF. Methods Expression of PLGF mRNA and protein in surgical specimens which including 10 samples of hepatic cirrhosis liver tissue and 8 samples of normal hepatic tissues were detected by RT-PCR and immunohistochemistry respectively. Results Levels of mRNA and protein of PLGF expressed in hepatic cirrhosis liver tissue were higher than those in normal hepatic tissue significantly （all P＜0.01）. Conclusion PLGF which got higher expression in the tissue of hepatic cirrhosis not only take part in the processes of hepatic cirrhosis， but also possibly play important roles in the processes of tumorigenesis in hepatic cirrhosis liver tissue.

[Key words] Viral hepatitis type B； Hepatic cirrhosis； Placenta growth factor

肝硬化是一種常見的慢性肝病，是由一種或多種病因長期或反復作用，引起肝臟彌漫性損害。在我國，病毒性肝炎（尤其是乙型）是引起肝硬化的主要原因[1]。胎盤生長因子（placenta growth factor，PLGF）屬血管內皮生長因子家族，它最早于1991年由Maglione等從人的胎盤cDNA文庫中分離純化而得，目前關于肝硬化組織中PLGF表達的研究國內外鮮見報道。本實驗通過研究PLGF在肝硬化組織中的表達，探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標本

2005年1月～2008年12月收集于浙江省溫州醫學院附屬第一醫院手術切除的肝組織及肝移植手術供體肝。肝硬化肝組織（tissue of hepatic cirrhosis liver）10例，均為肝硬化終末期行肝移植術的切除肝，病理診斷為肝硬化肝組織。正常肝組織（normal hepatic tissue）8例（肝移植手術供體肝，病理證實為正常肝組織），作為對照組。

1.2 實驗試劑

即用型SABC免疫組化試劑盒，PLGF多克隆抗體（ABCAM公司）；DAB顯色劑（北京中杉金橋生物技術有限公司）；Trizol（Sigma公司）；焦碳酸二乙酯（DEPC）（Sigma公司）；總RNA提取試劑盒（美國Life Technologies公司）；RT-PCR試劑盒（大連寶生物公司）。

1.3 PCR引物

引物序列通過Primer Premier 5.0軟件設計，經過PubMed Blast確認，由生工生物工程（上海）有限公司合成。引物序列：β-actin：正鏈5’-TCG ACA ACG GCT CCG GCA T-3’，負鏈5’-AAG GTG TGG TGC CAG ATT TTC-3’，產物241bp；PLGF：正鏈5’-CTG CTG TCT GCG GAG GAA-3’，負鏈5’-ACA AGG GAA CGA AGG ACG-3’，產物380bp。

1.4 免疫組化方法檢測標本PLGF蛋白表達

以4%多聚甲醛固定標本組織塊24h，常規石蠟包埋，連續石蠟切片，厚約4μm。石蠟切片脫蠟水化。3% H2O2室溫孵育20min，雙蒸水沖洗，PBS浸泡后，抗原修復采用枸櫞酸緩沖液中微波修復15min，PBS沖洗，山羊血清封閉，室溫孵育后傾去血清，滴加一抗工作液，37℃孵育2h，PBS沖洗后滴加二抗工作液，37℃孵育30min，PBS沖洗，滴加辣根酶標記SP工作液，37℃孵育30min，經PBS沖洗，DAB顯色劑顯色以及蘇木素復染。以PBS代替一抗作為陰性對照。PLGF免疫組化結果使用美國Image-Pro Plus 5.0專業圖像分析軟件測定平均光密度值，重復3次，取平均吸光度值作為蛋白的相對含量[2]。

1.5 RT-PCR方法檢測PLGF mRNA水平表達

Trizol法抽提總RNA，常規逆轉錄成cDNA后進行PCR擴增。在PCR儀內，94℃預變性5min；94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸60s，35個循環；72℃ 5min。4℃保存。2h內PCR產物電泳，電壓120V 30min。電泳結束后取出凝膠，Image Master VDS成像系統攝影存盤后應用計算機圖像分析軟件（Total lab V101）行灰度掃描分析。以目的基因與β-actin的PCR產物條帶灰度比值作為反映目的基因mRNA水平的相對指標，RT-PCR反應體系中未加入逆轉錄酶的作為空白對照[2]。

1.6 統計學處理

所有試驗數據進行正態性檢驗，組間比較使用t檢驗，均在SPSS11.5軟件上完成。

2 結果

2.1 PLGF免疫組化結果

肝硬化組的PLGF蛋白表達高于正常肝組（封三圖1、圖2），差異有顯著統計學意義（t=14.062，P＜0.01）。見表1。

2.2 PLGF RT-PCR結果

肝硬化組的PLGF mRNA產物條帶平均光密度比值明顯高于正常肝組（封三圖3），差異有顯著統計學意義（t=9.952，P＜0.01）。見表1。

3 討論

臨床上，對于慢乙肝患者的轉歸有肝炎-肝硬化-肝癌三部曲一說。其中，對于乙肝肝硬化的研究尤為值得重視，但既往研究中少有設正常肝組織對照。本研究中采用肝移植供體肝（病理診斷均為確切的正常肝，臨床上也排除了肝炎和慢性肝病）作為乙肝后肝硬化（病理診斷為肝硬化，未發現肝癌）的對照組，完善了實驗設計。

肝硬化的主要發病機制是肝臟組織在各種因素損傷下的持續性長期的炎癥導致的進行性纖維化，最終使肝小葉結構和血液循環改建而形成肝硬化[3]。多個研究表明胎盤生長因子與許多炎癥有關，在炎癥過程中由炎癥細胞產生并作為其趨化因子，參與如類風濕性關節炎、過敏反應多種炎性病理過程[4，5]。乙肝肝硬化的形成過程也可以說是一個炎癥性的病理過程，PLGF的產生可能與肝內受刺激的血管內皮細胞或者炎癥細胞有關。本實驗中，肝硬化組織中PLGF mRNA及蛋白有較高水平的表達，而正常肝幾乎無表達，證實PLGF高表達與肝硬化組織中不斷發生的炎癥反應密切相關，這種現象也說明不僅肝硬化形成過程是炎癥過程，而且肝硬化形成后的組織中同樣具有類似上述疾病炎癥病理過程的特點。因此，肝硬化形成后，病情并未就此穩定，而是仍在進展。而且PLGF的表達水平與炎癥程度具有一定的聯系，其相關性有待進一步探討。

此外，既往的研究中報道缺氧可以誘導血管內皮生長因子家族成員的高表達，缺氧上調VEGF基因表達主要與缺氧誘導的特異性DNA結合蛋白缺氧誘導因子密切相關[6，7]。PLGF作為該家族中的重要成員，應該具有此種特點，缺氧可能是引起肝硬化組織PLGF高表達的另一原因。乙肝肝硬化組織由于纖維組織的影響，肝組織細胞因血供不足而存在缺氧的狀態；PLGF在肝組織缺氧的環境中表達增強，與文獻報道符合。另外，PLGF的產生增多可以說是肝臟機體缺氧負反饋調節過程的一種反應，因為PLGF產生于缺氧環境，又可通過其生物學功能發揮著調節血管功能的作用，從而改善肝臟組織的血供。

因此，PLGF在乙肝后肝硬化的形成過程中表達增加，在肝臟炎癥性病理過程中扮演一定的角色，其機制有待進一步研究。此外，PLGF是參與多種腫瘤血管生成的重要的促血管生成因子，多種腫瘤的形成（包括肝癌）與PLGF有關[2，8，9]；并且，多個研究小組報道了PLGF在各種實體瘤中的表達上調，過度的PLGF表達導致腫瘤生長速度加快[10]；而約10%～15%的肝硬化患者可發生原發性肝癌。因此肝硬化組織中PLGF的高表達可能參與了肝硬化向肝癌發展的過程，甚至可能發揮了十分重要的作用，有待更多的實驗去證實。

[參考文獻]

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（收稿日期：2011-05-26）