不同梅毒血清學(xué)診斷方法的臨床檢測(cè)與效果評(píng)價(jià)

[摘要]目的 探討rTpN15-17-47-ELISA、RPR和TPPA三種用于梅毒血清抗體檢測(cè)方法的敏感性和特異性。方法 三種方法分別檢測(cè)50份無(wú)梅毒病史健康人血清、11例類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）、5例腎病綜合征（NS）及122例確診梅毒患者血清標(biāo)本中梅毒抗體，對(duì)各方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果 rTpN15-17-47-ELISA對(duì)所有健康人血清、RA患者及NS患者血清檢測(cè)結(jié)果均為陰性，對(duì)梅毒患者血清標(biāo)本檢測(cè)陽(yáng)性率為97.5%，與TPPA（96.7%）相似（P＞0.05），且均高于RPR（80.3%）。結(jié)論 本研究中建立的以重組融合蛋白質(zhì)rTpN15-17-47為抗原的ELISA有望成為高度敏感和特異的梅毒患者血清學(xué)篩查方法。

[關(guān)鍵詞]梅毒螺旋體；rTpN15-17-47-ELISA；血清學(xué)診斷

[中圖分類(lèi)號(hào)] R446.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2011）24-133-02

Clinical Evaluation of Different Serological Methods for Diagnosis of Treponema Pallidum

WU Ying1 HU Yujie2 SUN Aihua2

1.Zeguo Branch of Taizhou Combination of Chinese Traditional and Western Medicine Hospital，Zhejiang Province，Taizhou 317500，China；2.Zhejiang Medical College，Hangzhou 310053，China

[Abstract] Objective To evaluate the sensitivity and specificity of rTpN15-17-47-ELISA，RPR and TPPA methods in serological diagnosis of syphilis. Methods The serum samples from 50 healthy individuals，11 RA patients，5 NS patients and 122 syphilis patients were detected by using rTpN15-17-47-ELISA，RPR and TPPA. The detection effect of the ELISA was compared to those of RPR and TPPA. Results The detection results of rTpN15-17-47-ELISA was negative for the serum samples from healthy individuals，RA and NS patients，while presented 97.5% positive detection rates for the serum samples from syphilis patients. The positive detection rates of rTpN15-17-47-ELISA was similar to that of TPPA（96.7%）（P＞0.05），both the positive rates of rTpN15-17-47-ELISA and TPPA were significantly higher than that of RPR（80.3%）. Conclusion rTpN15-17-47-ELISA established in this study is great hopeful to become sensitivity and specificity methods for serological screening and detection of syphilis.

[Key words] Treponema pallidum；rTpN15-17-47-ELISA；Serological diagnosis

梅毒是由梅毒螺旋體（Treponema pallidum）感染引起的主要人類(lèi)性傳播性疾病（STD）之一[1]，因臨床表現(xiàn)多樣容易造成誤診、漏診。目前梅毒的實(shí)驗(yàn)室診斷主要依賴(lài)血清學(xué)方法，快速血漿反應(yīng)環(huán)卡片試驗(yàn)（RPR）是目前國(guó)內(nèi)最常用的梅毒臨床篩選試驗(yàn)，方法簡(jiǎn)便、快速，用于梅毒初篩，但特異性不強(qiáng)。明膠凝集試驗(yàn)（TPPA）為代表的特異性的梅毒確診試驗(yàn)，方法敏感、特異，但需以培養(yǎng)的梅毒螺旋體為特異性抗原，梅毒螺旋體培養(yǎng)困難、成本高，使TPPA難以普及成為梅毒篩選試驗(yàn)[2，3]。本研究利用孫愛(ài)華教授建立的以重組蛋白rTpN15-17-47為包被抗原的ELISA并檢測(cè)122份梅毒血清標(biāo)本，并對(duì)方法的敏感性和特異性進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 血清標(biāo)本來(lái)源

梅毒患者血清122份（臨床已確診）由浙江省臺(tái)州地區(qū)多家醫(yī)院提供，收集上述血清標(biāo)本醫(yī)院已進(jìn)行RPR和TPPA檢測(cè)。11例RA和5例NS無(wú)梅毒病史者血清標(biāo)本、50例無(wú)梅毒病史正常體檢者血清標(biāo)本來(lái)自浙江省臺(tái)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院。上述標(biāo)本采集時(shí)均獲得患者或體檢者的知情同意。

1.2 ELISAs建立與應(yīng)用

紫外分光光度法測(cè)定重組蛋白rTpN15-17-47（孫愛(ài)華教授前期研究結(jié)果）濃度。50μg/mL rTpN15-17-47包被96孔板，37℃溫育2h后放置冰箱4℃過(guò)夜。次日洗滌3次，用8%BSA封閉。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，50份正常對(duì)照血清標(biāo)本1︰800稀釋后為一抗。二抗為HRP標(biāo)記羊抗人IgG（Jackson Immuno Research），顯色底物為T(mén)MB，測(cè)定終止反應(yīng)后各孔OD450值，計(jì)算得正常血清OD450均值和SD值。1︰800稀釋的梅毒患者、RA及NS無(wú)梅毒病史者血清用我們建立的rTpN15-17-47-ELISA檢測(cè)，若被檢標(biāo)本OD450值≥陰性對(duì)照OD450均值＋3SD者為陽(yáng)性。

1.3 RPR和TPPA檢測(cè)

按試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)上述梅毒患者血清、RA及NS無(wú)梅毒病史者血清標(biāo)本和健康人血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)并進(jìn)行結(jié)果判定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用STATA8.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件中的χ2檢驗(yàn)，對(duì)不同檢測(cè)方法檢測(cè)陽(yáng)性率進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同方法檢測(cè)梅毒患者血清陽(yáng)性率

檢測(cè)上述50份健康人血清標(biāo)本的OD450均值和SD值分別為0.25和0.04，故陽(yáng)性判斷參考值為OD450值≥0.37。根據(jù)上述陽(yáng)性判斷參考值，122例梅毒患者血清標(biāo)本用rTpN15-17-47-ELISA檢測(cè)陽(yáng)性率為97.5%（119/122）。RPR和TPPA對(duì)上述血清標(biāo)本檢測(cè)陽(yáng)性率分別為80.3%（98/122）、96.7%（118/122）。見(jiàn)表1。

2.2 不同梅毒血清學(xué)檢測(cè)方法比較

rTpN15-17-47-ELISA檢測(cè)梅毒血清患者的陽(yáng)性率為97.5%，與TPPA檢測(cè)陽(yáng)性率96.7%比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.15，P＞0.05），但rTpN15-17-47-ELISA和TPPA檢測(cè)陽(yáng)性率均明顯著高于RPR陽(yáng)性率80.3%（χ2=18.37和16.14，P＜0.05）。TPPA是目前臨床實(shí)驗(yàn)室采用的梅毒確診試驗(yàn)，RPR和rTpN15-17-47-ELISA檢測(cè)結(jié)果與TPPA比較，符合率分別為83.1%和99.2%，未見(jiàn)TPPA陰性而RPR檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性情況，但另有2份梅毒患者血清標(biāo)本TPPA陰性而rTpN15-17-47-ELISA結(jié)果陽(yáng)性。見(jiàn)表2。

3 討論

梅毒血清學(xué)試驗(yàn)有非Tp抗原試驗(yàn)和Tp抗原試驗(yàn)兩大類(lèi)，非Tp抗原試驗(yàn)常見(jiàn)的前者如RPR及甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)（TRUST）等，常用于梅毒患者篩查和療效監(jiān)測(cè)，由于采用心磷脂作抗原、特異性較差，故有RA等少數(shù)疾病患者可出現(xiàn)RPR檢測(cè)假陽(yáng)性[3]。Tp抗原試驗(yàn)特異性高，但是需制備大量Tp抗原。目前Tp人工培養(yǎng)物主要依賴(lài)于Nichols株接種兔睪丸傳代和繁殖，產(chǎn)量很低，生產(chǎn)成本高[2]。利用基因工程手段合成重組蛋白具有Tp人工培養(yǎng)物相同的抗原性，不僅縮短獲得抗原的時(shí)間，且極大降低了生產(chǎn)成本。

TpN15、TpN17、TpN37、TpN44.5和TpN47被認(rèn)為是最有臨床應(yīng)用前景的梅毒螺旋體外膜蛋白抗原，利用生物工程獲得上述外膜蛋白的重組蛋白作包被抗原建立的ELISAs檢測(cè)血清抗體方法已有不少研究報(bào)道，但多為單一外膜蛋白為基礎(chǔ)建立的ELISAs，單一重組抗原靈敏度和特異性較低[3，4]。也有少量實(shí)驗(yàn)室建立二個(gè)或多個(gè)外膜蛋白通過(guò)多次包被增加方法的敏感性，由于多個(gè)抗原需各自表達(dá)與提純不僅增加了制備費(fèi)用也可能造成更多的誤差，不利于方法標(biāo)準(zhǔn)化和推廣應(yīng)用[4-6]。

本研究中，我們梅毒螺旋體主要外膜蛋白TpN15、TpN17和TpN47通過(guò)生物工程手段構(gòu)建的融合抗原TpN15-17-47為包被抗原，建立檢測(cè)梅毒血清抗體的ELISA檢測(cè)臨床確診梅毒患者血清標(biāo)本。由于同時(shí)具備三個(gè)主要抗原，提高了方法的敏感性，檢測(cè)結(jié)果也表明建立的rTpN15-17-47-ELISA方法檢測(cè)梅毒血清標(biāo)本與確診試驗(yàn)TPPA無(wú)顯著性差異，顯著高于目前臨床常用篩選試驗(yàn)RPR，同時(shí)建立的融合抗原TpN15-17-47可以保證多個(gè)抗原一次表達(dá)，能有限降低檢測(cè)成本。rTpN15-17-47-ELISA有望成為快速、廉價(jià)、敏感性和特異性較高的梅毒患者血清學(xué)篩查方法。

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2011-06-27）