δ阿片受體激動劑DADLE對膿毒癥大鼠血漿高遷移率族蛋白1水平的影響

[摘要]目的 研究δ阿片受體激動劑DADLE（D-Ala2-D-Leu5-enkephalin）對膿毒癥大鼠血漿高遷移率族蛋白1（HMGB1）水平的影響。方法 將96只Sprague-Dawley （SD）大鼠分為假手術組（SO）、膿毒癥組（SEP）、DADLE組[制模后立即給藥DADLE（5mg/kg，腹腔內注）]， 每組32只。采用改良盲腸結扎穿孔方法（CLP）建立大鼠膿毒癥模型，于制模后6h，12h，18h，24h每組各取8只處死取材。ELISA法檢測血漿HMGB1水平。結果 12h 時SEP組和DADLE組HMGB1水平與SO組相比均明顯升高（P＜0.05），且DADLE組明顯低于SEP組（P＜0.05）；18h時，SEP組和DADLE組HMGB1水平達到最高。同樣DADLE組明顯低于SEP組（P＜0.05）；24h時SEP組和DADLE組HMGB1水平較18h有所降低，但DADLE組仍明顯低于SEP組（P＜0.05）。結論 DADLE能明顯降低膿毒癥大鼠血漿HMGB1水平。

[關鍵詞] DADLE；膿毒癥；高遷移率族蛋白1

[中圖分類號] R631 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2011）24-17-02

Effect of Delta-opioid Receptor Agonist on Serum HMGB1 Level in Rat with Sepsis

WANG Ping TANG Chengwu FENG Wenming BAO Ying ZHU Ming

Department of Hepatobiliary Surgery and Molecular Surgery，the First People’s Hospital Affiliated to Huzhou University Medical College，Huzhou 313000，China

[Abstract] Objective To study the effect of delta-opioid receptor agonist（DADLE） on serum HMGB1 level in rat with sepsis. Methods All 96 SD rats were randomly divided into sham operated group （SO），septic group（SEP）and DADLE group（DADLE）.Septic model was produced by cecal ligation and puncture（CLP）. In SO group，the abdomen was opened without any other treatment.In DADLE group，DADLE was administered at a dose of 5mL/kg by intraperitoneal injection after CLP. Rats were sacrificed at 6h，12h， 18h and 24h after CLP. HMGB1 level was determined by ELISA. Results The serum HMGB1 levels of SEP and DADLE groups began to increase at 12h，and reached the peak around 18h after CLP. Notably， serum HMGB1 levels of DADLE group at 12h，18h and 24h were significantly lower than those of SEP group（P＜0.05）. Conclusion DADLE could significantly decrease serum HMGB1 level of septic rat.

[Key words] DADLE；Sepsis；CLP；High-mobility Group box 1 Protein

膿毒癥是嚴重感染、創傷及大手術等應激狀況時常見的并發癥，已經成為當今重癥監護室的首要死亡原因[1]。膿毒癥時多種炎癥因子參與了膿毒癥的病理過程，高遷移率族蛋白B1（high mobility group box1 protein，HMGB1）作為潛在晚期炎性因子，是膿毒癥致死效應的重要炎性介質，干預HMGB1可有效防止膿毒癥和MODS的發生與發展[2，3]。δ阿片受體激動劑DADLE（D-Ala2-D-Leu5-enkephalin）是一種人工合成的非選擇性δ阿片受體激動劑， 我們以往的研究發現DADLE能明顯降低膿毒癥死亡率[4]，但是其機制尚不明確，本研究旨在探討其對膿毒癥大鼠血漿HMGB1水平的影響，從而對DADLE在膿毒癥中的保護作用進行初步闡述。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DADLE（D-Ala2-D-Leu5-enkephalin）分子式C29H39N507，購自美國Sigma公司。大鼠HMGB1 ELISA定量檢測試劑盒購自日本Shino-Test公司。

1.2 動物分組及膿毒癥模型建立

清潔級健康SD雄性大鼠96只，體重270～320g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，隨機分為假手術組（SO組）、膿毒癥組（SEP組）和DADLE組，每組32只，采用盲腸結扎穿孔方法建立大鼠膿毒癥模型，參照Wichterman 等[5]的改良的盲腸結扎穿孔（CLP） 方法， 將盲腸穿孔數由2個增至4個，假手術組除不施行CLP， 其余操作同SEP組，DADLE組在模型建立后立即按5mL/kg體重腹腔注射濃度為0.5mg/mL的DADLE。CLP后6h、12h、18h、24h每組斷頸處死8只大鼠，取血ELISA法檢測血漿HMGB1濃度。

1.3 統計學處理

采用SPSS10.0軟件處理。計量資料用（χ±s）表示，多組間比較用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

DADLE對膿毒癥大鼠血漿HMGB1水平的影響見表1。CLP后6h SEP組和DADLE組血漿HMGB1水平開始升高，但三組間無明顯差異（P＞0.05）；12h 時SEP組和DADLE組HMGB1水平與SO組相比均明顯升高（P＜0.05），且DADLE組明顯低于SEP組（P＜0.05）；18h時SEP組和DADLE組HMGB1水平達到最高。同樣DADLE組明顯低于SEP組（P＜0.05）；24h 時SEP組和DADLE組HMGB1水平較18h有所降低，但DADLE組仍明顯低于SEP組（P＜0.05）。

3 討論

大鼠CLP 模型是目前公認的與臨床相關性較強的膿毒癥模型，血中內毒素水平、細胞因子升高幅度，內毒素檢出率及細菌培養（包括革蘭陽性菌和革蘭陰性菌）陽性率高、單純的抗炎治療在此模型失敗都與臨床相似[6]。

膿毒癥時細菌產生內毒素導致大量炎癥因子釋放，包括早期炎癥因子（如TNF-α和IL-1β）和晚期炎癥因子（如HMGB1），正是這些炎癥因子導致器官組織損傷[7，8]。然而一些針對早期炎癥因子的治療在臨床上并未收到良好的療效，因為早期炎癥因子在炎癥發展的早期階段就已經開始釋放，并未給拮抗治療留下足夠的時間窗。況且在全身炎癥反應啟動之后再使用 TNF-α和IL-1β的抑制劑也無法取得明顯的療效 [9-11]。有學者發現，使用抗HMGB1抗體能明顯減少膿毒癥小鼠的死亡率，即使是在膿毒癥發生24h后仍有明顯的保護作用[12]，這意味著針對HMGB1的治療策略具有良好的時間窗，因此HMGB1可能是治療膿毒癥的新靶點。本研究中DADLE組血漿HMGB1水平在12h，18h和24h均明顯低于SEP組，表明DADLE能明顯抑制血漿HMGB1的表達，減輕全身炎癥反應，從而對膿毒癥大鼠起到一定的保護作用。

目前對膿毒癥發生機制尚不完全清晰，且難于提出有效的治療措施，我們運用δ阿片受體激動劑DADLE處理膿毒癥大鼠后，發現血漿HMGB1水平明顯降低，因此我們推測DADLE能延緩甚至減少全身炎癥反應綜合征的發生，從而改善膿毒癥預后，這是對膿毒癥治療的新的嘗試，為膿毒癥的治療提供了新的思路。

[參考文獻]

[1] Angus DC，Linde-Zwirble WT，Lidicker J，et al.Epidemiology of severe sepsis in the United States： analysis of incidence，outcome，and associated costs of care[J].Crit Care Med，2001，29：1303-1310.

[2] 姚詠明， 盛志勇.我國創傷膿毒癥基礎研究新進展[J].中華創傷雜志，2003，19：9-12.

[3] 姚詠明，徐珊，盛志勇.高遷移率族蛋白B1的組織損傷效應及其干預途徑[J].中國醫學科學院學報，2007，29：459-465.

[4] 馮文明，朱鳴，鮑鷹，等. δ阿片受體激動劑D-丙2，D-亮5腦啡肽對膿毒癥大鼠死亡率的影響[J]. 中華危重癥醫學雜志（電子版），2009，2：25-28.

[5] Wichterman KA，Baue AE，Chaudry IH. Sepsis and septic shock--a review of laboratory models and a proposal[J].J Surg Res，1980，29：189-201.

[6] Aird WC. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome[J]. Blood，2003，101：3765-3777.

[7] Alleva LM， Budd AC，Clark IA.Systemic release of high mobility group box 1 protein during severe murine influenza[J]. J Immunol，2008，181：1454-1459.

[8] Wang H， Bloom O， Zhang M，et al. HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice[J]. Science，1999，285：248-251.

[9] Abraham E， Anzueto A， Gutierrez G，et al. Double-blind randomised controlled trial of monoclonal antibody to human tumour necrosis factor in treatment of septic shock. NORASEPT II Study Group[J]. Lancet，1998，351：929-933.

[10] Abraham E， Laterre PF， Garbino J，et al. Lenercept （p55 tumor necrosis factor receptor fusion protein） in severe sepsis and early septic shock： a randomized， double-blind， placebo-controlled， multicenter phase Ⅲ trial with 1，342 patients[J]. Crit Care Med，2001，29：503-510.

[11] Fisher CJ， Dhainaut JF， Opal SM，et al. Recombinant human interleukin 1 receptor antagonist in the treatment of patients with sepsis syndrome. Results from a randomized， double-blind， placebo-controlled trial. Phase Ⅲ rhIL-1ra Sepsis Syndrome Study Group[J]. JAMA，1994，271：1836-1843.

[12] Fink MP.Bench-to-bedside review：High-mobility group box 1 and critical illness[J]. Crit Care，2007，11：229.

（收稿日期：2011-06-17）