恩度抗小鼠肝癌H22作用研究

【摘要】 目的 借助鼠模型觀察恩度應用后腫瘤從開始生長到長到一定規模時腫瘤組織的生長情況。方法 建立肝癌H22小鼠模型，共32只小鼠，隨機分為四組。在不同時間分別對各組給藥，分析實驗第10、14、18天四組小鼠腫瘤體積情況。結果 實驗第10天、第14天所有給藥組腫瘤體積與對照組腫瘤體積比較，差異無統計學意義。實驗第18天：接種腫瘤當天開始腹腔給藥組（B組）腫瘤體積與對照組（D組）腫瘤體積比較，差異有統計學意義（P<0.05）。接種腫瘤前開始給藥組（A組）和接種腫瘤后開始給藥組（C組）腫瘤體積與對照組（D組）腫瘤體積比較差異無統計學意義。結論 單獨應用恩度有抗腫瘤作用，接種腫瘤時為最佳給藥時機，而且需給藥18d才能體現恩度抗腫瘤作用。

【關鍵詞】 肝癌； 治療； 恩度； 小鼠； H22肝癌細胞株

血管內皮抑素(Endostatin，ES)是膠原XⅧ在C端的一個水解片段，大小約20 kD，最初于1997年由O’Reilly等［1］在鼠成血管細胞瘤株培養液中分離提純得到的一種內源性糖蛋白。ES通過抑制內皮細胞的增殖、遷移以及誘導凋亡等機制來抑制腫瘤血管生成已得到大量研究的證實［2］。我國學者在血管內皮抑素的結構上增加了9個氨基酸，成功解決了重組人內皮抑素復性難和穩定性差的問題，成為我國第一個上市的血管生成抑制劑類抗腫瘤藥物(恩度)，在針對非小細胞肺癌(NSCLC)的聯合化療臨床試驗中顯示出良好的療效［3］，但對其他惡性腫瘤治療的效果鮮有報道。從基礎研究資料看，恩度的作用都指向抗血管生成，但作用于生成過程中的哪一個環節也未見報道，所以借助于鼠模型觀察恩度應用后腫瘤從開始生長到長到一定規模時腫瘤組織的生長情況，則能為下一步確定恩度的作用機制建立研究平臺。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 病源 肝癌H22瘤株，由中國藥品制品鑒定所引進。

1.1.2 實驗動物 4~5周昆明小鼠，雄性32只，平均體重19~22g/只，由山西省中醫研究所動物室提供。

1.1.3 實驗環境 動物室室溫22℃~24℃，相對濕度40%~45%，日光燈12h人工照明，專用鼠糧自由進食，潔凈水自由飲用，動物實驗室為清潔級。

1.2 實驗方法

1.2.1 肝癌H22小鼠模型的建立 將冷凍保存在-80℃冰箱中的H22肝癌細胞復蘇后，注射入昆明小鼠左腋下，7日后，腫瘤生成明顯。在無菌條件下取腫瘤，以培養液調整其中瘤細胞密度至1×107個細胞/ml，用注射器吸取腫瘤懸液0.2ml注入32只4~5周齡的雄性昆明小鼠右腋下的皮下，并將32只小鼠隨機分為A、B、C、D四組，每組8只，建立動物模型。

1.2.2 實驗分組 將32只小鼠按隨機分組方法，分成4組（A組、B組、C組、D組），每組8只。

1.2.3 各組用藥方法 A組開始給藥時間為實驗第1天。實驗第5天所有小鼠接種腫瘤。給藥方法：恩度3mg/kg注入腹腔，每日1次，直至小鼠被宰殺或小鼠死亡。A組：于實驗第1天（接種腫瘤日前4d）開始給藥。B組：于實驗第5天（接種腫瘤日）開始給藥。C組：于實驗第9天（接種腫瘤日后第4天）開始給藥。D組：對照組，只造模。

1.3 小鼠腫瘤指標測定 將接種后的昆明小鼠在清潔級動物室內飼養，每天觀察接種腫瘤生長情況。觀察實驗第10、14、18天各組小鼠的腫瘤體積。

1.3.1 小鼠體重 每日測量各小鼠體重，使用電子天平測定。

1.3.2 腫瘤大小 每日測量各小鼠左腋下腫瘤大小（使用游標卡尺測定），計算腫瘤體積。腫瘤體積=長徑×橫徑2/2。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0專用統計軟件對數據進行統計分析。使用單因素方差分析對實驗數據結果進行方差齊性檢驗和統計分析，進一步采用LSD-t檢驗對數據進行多組間的兩兩比較分析與推斷。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

實驗第10天、第14天所有給藥組腫瘤體積與對照組腫瘤體積比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。在實驗第18天，接種腫瘤當天開始給藥組（B組）腫瘤體積與對照組（D組）腫瘤體積比較，有統計學差異（P＜0.05），接種腫瘤前開始給藥組（A組）和接種腫瘤后開始給藥組（C組）腫瘤體積與對照組（D組）腫瘤體積差異無統計學意義（P>0.05）。

3 討論

腫瘤的發生、發展和轉移與血管的生成關系密切。腫瘤的生長有兩個明顯不同的階段，即從無血管的緩慢生長階段轉變為有血管的快速增殖階段［4］，當其直徑達到1~2mm后，若無新生血管生成以提供營養，就不能繼續生長。腫瘤血管形成機制又是極其復雜的，從某種意義上來講，是機體對腫瘤本身的血管形成機制和抑制血管形成機制的失衡造成的。

分子水平上，血管生成受兩大類因子調控，分別為促血管生成因子和血管生成抑制因子［5］。血管形成抑制因子有多種，目前對血管內皮抑素的研究較為透澈，它是ⅩⅧ型膠原的一個片段，可與多種細胞表面蛋白作用，調節細胞的粘附和遷移。腫瘤停滯因子是Ⅳ型膠原的一個28000的片段，通過作用于整合素αVβ3達到抑制血管生成的作用。TSP-1是第一個被發現的內源性血管生成抑制因子，儲存于血小板的α顆粒，其作用受體為CD36［6］。IL-12可以通過下調VEGF及FGF的表達抑制荷瘤免疫缺陷鼠的腫瘤生長［7］，此外，有證據表明提高血管內皮抑素、腫瘤停滯因子等含量可以抑制腫瘤血管［8］。迄今為止，已發現很多血管抑制因子，并且已被臨床應用。

目前流行的觀點是：腫瘤的血管形成是局部微循環中促血管生成因子和血管生成抑制因子之間的平衡發生偏斜的結果［9］。理論上講，任何一種可以恢復促血管生成因子和抑制血管生成因子平衡的治療都可引起血管的正常化。恩度是我國第一個上市的血管生成抑制劑類抗腫瘤藥物，本實驗研究單獨應用恩度是觀察其抗小鼠肝癌H22細胞株移植腫瘤的作用，并且選擇接種腫瘤前、接種腫瘤當天、接種腫瘤之后3種開始給藥時間，動態觀察恩度應用后腫瘤生長情況，希望通過本實驗研究發現恩度抗腫瘤的最佳給藥時機，探索恩度與血管生成的相關性。結果表明實驗第10天、第14天所有給藥組腫瘤體積與對照組腫瘤體積比較差異無統計學意義；在實驗第18天，接種腫瘤當天開始給藥組（B組）腫瘤體積與對照組（D組）腫瘤體積差異有統計學意義（P<0.05），而接種腫瘤前開始給藥組（A組）和接種腫瘤后開始給藥組（C組）腫瘤體積與對照組（D組）腫瘤體積沒有統計學差異。說明腹腔注射恩度有抗腫瘤作用，與之前的報道相符［1，2］；用藥時機和給藥時間體現恩度抗腫瘤效果。本實驗提示，接種腫瘤當日開始給藥且給藥時間達18d能體現恩度抗腫瘤作用；而接種腫瘤前和腫瘤開始生長后給藥不能體現恩度抗腫瘤效果。由此可見，恩度有可能只作用于新生血管，提前給藥對腫瘤血管著床以及腫瘤血管生長均無效，腫瘤生長后給藥對腫瘤血管生長也無效，其機制有待進一步研究。為進一步研究恩度的抗腫瘤血管機制可對本實驗所留取腫瘤標本進行血管密度觀察，比較不同時間、不同組別小鼠腫瘤血管密度之間的差別。

綜上所述，接種腫瘤當天開始腹腔注射恩度組（B組）小鼠腫瘤比單純造模組（D組）小鼠腫瘤小，接種腫瘤前、后開始給藥組小鼠腫瘤體積與空白對照組小鼠腫瘤體積無統計學差異。接種腫瘤當天開始腹腔注射恩度有抗腫瘤作用，而且需給藥18d，具體機制有待進一步研究。因此，隨著恩度抗腫瘤機制研究的進一步深入，恩度有望成為癌癥治療的必不可少的重要藥物之一。

參考文獻

［1］O’Reilly MS，Boehm T，Shing Y，et al.Endostatin：An endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth.Cell，1997，99(2)：277-295.

［2］Digtyar AV，Pozdnyakova NV，Feldman NB，et al.Endostatin：current concepts about its biological role and mechanisms of action.Biochemistry(Mosc)，2007，72(3)： 235-246.

［3］王金萬，孫燕，劉永煜，等.重組人血管內皮抑素聯合NP方案治療晚期NSCLC隨機、雙盲、對照、多中心Ⅲ期臨床研究.中國肺癌雜志，2005，8(4)：283-290.

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［9］Kusters B，Leenders WP，Wesseling P，et al. Vascular endothelial growth factor-A(165) induces progression of melanoma brain metastases without induction of sprouting angiogenesis. Cancer Res，2002，62（2）：341-345.

（收稿日期：2011-04-06）

（本文編輯：梅宏偉）