余甘子對大鼠酒精性脂肪肝的炎癥抑制作用研究

[摘要] 目的 觀察余甘子對大鼠酒精性脂肪肝中炎癥反應(yīng)的抑制作用。 方法 通過高脂及乙醇混合飼料喂養(yǎng)大鼠8周以誘導(dǎo)酒精性脂肪肝的形成，同時每日給予一部分大鼠余甘子萃取物0.06 mL/g以研究余甘子的保護作用。8周后檢測各組大鼠血生化和肝臟中相關(guān)炎癥指標(biāo)。 結(jié)果 相較于對照組，酒精肝大鼠血清中谷丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）顯著上升（P ＜ 0.01），肝組織切片中可見明顯炎癥位點及脂肪顆粒累積，肝臟中炎癥因子（TNF-α，IL-1β和COX-2）的表達量亦顯著上升（P ＜ 0.01）。加入余甘子協(xié)同處理的大鼠以上指標(biāo)均有明顯改善（P ＜ 0.05或P ＜ 0.01）。 結(jié)論 在大鼠酒精肝模型中余甘子對酒精肝有治療作用。

[關(guān)鍵詞] 酒精性脂肪肝；余甘子；炎癥

[中圖分類號] R575.5 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2012）04-0009-03

Ameliorative effect of Phyllanthus emblica on inflammatory response in rat alcoholic fatty liver disease model

YU Hongbin ZHU Wei DAI Chuang FENG Wenming

Department of General Surgery Institute of Molecular Surgery， the First People's Hospital of Huzhou， Huzhou 313000， China

[Abstract] Objective To investigate the ameliorative effect of Phyllanthus emblica on inflammatory response in rat alcoholic fatty liver disease (AFLD) model. Methods Rats were fed high-fat and ethanol diet for 8 weeks to induce AFLD. During the development of AFLD， some of the rats were injected with 0.06 mL/g extracts of Phyllanthus emblica per day. After 8 weeks， serum and hepatic samples were collected for measurements. Results AFLD rats showed significantly higher levels of ALT and AST in serum (P ＜ 0.01). Fat accumulation and inflammatory sites were also seen in AFLD rat livers， accompanied by up-regulation of hepatic pro-inflammatory mediators (P ＜ 0.01). Co-treatment of Phyllanthus emblica effectively ameliorated AFLD phenotypes (P ＜ 0.05 or P ＜ 0.01). Conclusion Phyllanthus emblica plays protective roles in rat AFLD model.

[Key words] Alcoholic fatty liver disease; Phyllanthus emblica; Inflammation

過量飲酒或飲用其他酒精性飲料是全球范圍內(nèi)引發(fā)各種慢性疾病的重要誘因之一。2004年全球約3.8%的個體死亡原因與酒精的攝取有關(guān)。長期過量飲酒（即每日超過20 g酒精）可能會誘導(dǎo)脂肪性肝炎、酒精性脂肪肝（酒精肝），甚至肝硬化和肝癌的形成[1，2]。飲酒相關(guān)的健康問題已經(jīng)成為我國所面臨的一大公共衛(wèi)生和社會問題[3]。酒精肝的致病因素單一，但是其發(fā)生機制非常復(fù)雜，目前尚未完全清楚。有研究指出，酒精攝入后導(dǎo)致的脂肪性肝炎是酒精肝形成過程中不可或缺的階段，所以針對酒精肝的炎癥抑制可能是一種有效的治療策略[4]。

余甘子（Phyllanthus emblica L.），又名油柑子、橄欖子、滇橄欖等等，為大戟科葉下珠屬植物余甘子的成熟果實，是一種常用藏藥。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)余甘子是一種有效的抗氧化劑，同時亦有許多抗病方面的效用，包括止痛、抗菌、抗炎癥、防突變、抗腫瘤以及肝臟保護等等[5]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠肝纖維化模型中，余甘子可以降低大鼠肝臟纖維化指標(biāo)因子，同時通過提高超氧化物歧化酶（SOD）活性和降低促炎癥因子水平發(fā)揮抗氧化和抗炎癥的作用。由于氧化應(yīng)激和炎癥的出現(xiàn)亦是酒精肝的標(biāo)志事件，該研究提示余甘子可能在酒精肝模型中發(fā)揮著類似的作用[6]。迄今為止，尚未有關(guān)于余甘子預(yù)防和治療酒精肝疾病的報道，所以本研究通過高脂混合乙醇飼料誘導(dǎo)大鼠形成酒精肝，通過觀察誘導(dǎo)酒精肝的同時給予余甘子對大鼠各項組織學(xué)和生物化學(xué)指標(biāo)產(chǎn)生的影響，以研究余甘子對大鼠酒精肝的保護尤其是對炎癥反應(yīng)的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

雌性Wistar大鼠由上海斯萊克實驗動物有限公司提供；余甘子萃取流程參考王文光等[7]方法：取大約5 g研磨自晾干的余甘子果實的粉末，在40 ℃條件下溶于100 mL三蒸水中約1 h。待溶液降到室溫后，通過Whatman濾紙過濾，收集液體萃取物放置于避光的4 ℃環(huán)境備用。余甘子液體萃取物中包含約86%水分、7%糖類、3.4%的抗壞血酸（維生素C）、2.2%的單寧酸和0.7%的類黃酮；谷丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）檢測試劑盒購于TECO Diagnostics公司；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）和環(huán)氧合酶-2（COX-2）的引物設(shè)計均基于Genbank數(shù)據(jù)庫并參考Primer Bank數(shù)據(jù)庫。引物序列如表1所示。引物合成由寶生物工程有限公司完成。三種基因的抗體均購自于Santa Cruz公司；SV Total RNA試劑盒購自于Promega公司；SYBR ExScript RT-PCR購于Takara公司；總蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物公司。

1.2 方法

1.2.1 酒精肝動物模型的建立 大鼠酒精肝模型參考Tipoe GL的建模方法[8]。雌性Wistar大鼠（200～220 g）適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后分為三組：對照組、酒精肝組和酒精肝余甘子協(xié)同處理組，每組6只大鼠。對照組喂養(yǎng)普通大鼠飼料和純凈水。酒精肝組和酒精肝余甘子協(xié)同處理組每日喂飼包含8%酒精、魚油、蛋白質(zhì)和葡萄糖的飼料8周以誘導(dǎo)酒精肝的形成。同時，酒精肝余甘子協(xié)同處理組每日另注射0.06 mL/g的余甘子萃取物。8周后取各組大鼠的肝臟組織和血清進行組織學(xué)和生物化學(xué)測定。

1.2.2 組織學(xué)分析 肝臟組織固定于10%的磷酸鹽緩沖的福爾馬林中，然后以石蠟包被制成5 μm厚的組織切片。切片使用蘇木精-伊紅雙染法進行肝臟內(nèi)脂肪堆積的評分分析。脂肪堆積評分標(biāo)準：脂肪顆粒占背景0～25%的區(qū)域為1分；25%～50%為2分；50%～75%為3分；75%以上為4分。

1.2.3 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 大鼠肝臟組織經(jīng)液氮研磨后使用SV Total RNA試劑盒提取總RNA，隨后根據(jù)SYBR ExScript RT-PCR試劑盒的說明將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-20℃下保存。

1.2.4 熒光實時定量PCR（Real-time PCR） Real-time PCR按照SYBR ExScript RT-PCR建議的體系和條件于Applied Biosystems Prism 7900 Real-time PCR儀器上完成，所有引物的退火溫度均優(yōu)化至60 ℃。人類GAPDH作為內(nèi)參照進行同步PCR擴增（表1）。Real-time PCR結(jié)果使用2-ΔΔCt法進行分析并以對照組百分數(shù)的形式于結(jié)果中表示。

1.2.5 免疫印跡分析（Western blot） 按照總蛋白試劑盒的方法提取肝臟組織總蛋白后使用BCA法（Bio-Rad）定量，每個樣品取150 μg總蛋白進行免疫印跡分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗結(jié)果采用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用方差分析，兩兩比較時采用SNK法，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 余甘子對酒精肝內(nèi)肝損傷的保護

大鼠經(jīng)高脂混合乙醇飼料喂養(yǎng)8周后，與正常組相比，肝臟小葉中央靜脈附近出現(xiàn)明顯的細胞壞死和炎癥部位，同時整個肝臟中可見大量脂肪顆粒堆積。加入余甘子協(xié)同處理后，肝內(nèi)壞死及炎癥部位顯著減少，脂肪堆積評分分值明顯下降（圖1及表2）。此外，相比較于對照組，酒精肝大鼠血清中ALT和AST的表達量顯著上升（P值分別為0.005 8和0.007 9），提示肝損傷的發(fā)生。加入余甘子協(xié)同處理后，大鼠血清中ALT和AST下降到與對照組大鼠接近的水平（P值為0.033 1，表2）。

2.2 余甘子對肝內(nèi)促炎癥因子的影響

與對照組相比，酒精肝大鼠肝內(nèi)TNF-α、IL-1β和COX-2的mRNA及蛋白表達水平均顯著上升（P值分別為0.000 7、0.007 2和0.000 3），提示肝內(nèi)存在相當(dāng)程度的炎癥反應(yīng)。加入余甘子協(xié)同作用后，相比較于酒精肝組大鼠，三種促炎癥因子的表達水平均有顯著下降，其中TNF-α和IL-1β下降到接近對照組的水平（P值分別為0.006 4、0.008 8和0.003 9，圖2）。

3 討論

本研究通過參考Tipoe GL等[8]的酒精性脂肪肝建模方法，利用高脂肪飼料輔以酒精自由喂飼8周成功建立了雌性大鼠酒精肝模型。從血清生化指標(biāo)、肝臟組織學(xué)檢驗和肝內(nèi)炎癥因子的表達來看，本模型基本復(fù)制了酒精肝中各種標(biāo)志性病理事件。同時相比于雄性大鼠，雌性大鼠對于酒精肝的耐受能力更差，所以本模型完全以雌性大鼠作為研究對象，以期獲得更為明顯的酒精肝損傷。在誘導(dǎo)酒精肝形成的8周內(nèi)我們通過每日注射0.06 mL/g的余甘子萃取物作為協(xié)同處理，有效地減少了肝臟內(nèi)細胞壞死、炎癥部位的出現(xiàn)和脂肪顆粒的堆積，同時亦將血清內(nèi)提示肝損傷的ALT和AST表達量降低到了對照組水平，提示余甘子對由酒精肝引起的肝臟損傷具有有效的保護作用。在分子生物學(xué)的角度上，酒精肝大鼠中TNF-α、IL-1β和COX-2的表達水平明顯升高，提示酒精肝中肝內(nèi)發(fā)生了嚴重的炎癥反應(yīng)。而余甘子的協(xié)同處理從基因轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上均顯著降低了此三種促炎癥因子的表達水平，亦反映了余甘子對炎癥反應(yīng)的抑制作用。

雖然酒精肝的發(fā)病機制非常復(fù)雜，現(xiàn)在并未完全研究清楚[9]，但是一般認為在攝入乙醇后，在肝內(nèi)乙醇脫氫酶（ADH）、細胞色素P450 2E1（CYP2E1）和過氧化氫酶（catalase）三套系統(tǒng)的作用下乙醇被氧化為乙醛，然后在線粒體中通過乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase）的作用轉(zhuǎn)化為醋酸鹽。這些代謝過程中會在肝細胞、炎癥細胞及非實質(zhì)細胞中產(chǎn)生對機體有害的自由基（ROS），提高體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，進而攻擊細胞內(nèi)的一些細胞器，例如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞核等，引起炎癥反應(yīng)和啟動細胞凋亡通路。在ROS的攻擊下，肝臟內(nèi)的Kupffer細胞會釋放出一些促炎癥因子，例如TNF-α、IL-1β和COX-2，引起炎癥反應(yīng)、纖維化反應(yīng)以及進一步促進ROS的釋放，惡化已有的酒精肝損傷[10]。余甘子對于肝臟細胞內(nèi)炎癥的抑制不僅阻止了炎癥損傷和細胞凋亡壞死，也明顯改善了肝內(nèi)脂肪堆積，扭轉(zhuǎn)了酒精肝的病理進程。但是余甘子是否能夠改善肝內(nèi)氧化應(yīng)激以及纖維化水平需要進一步的研究。

本研究結(jié)果證實在誘導(dǎo)酒精肝的同時加入余甘子同步處理可以明顯改善肝臟內(nèi)損傷，降低肝內(nèi)炎癥反應(yīng)，起到促進酒精肝恢復(fù)的效果。

[參考文獻]

[1] 莊輝，張華捷. 酒精性肝病的流行病學(xué)[J]. 胃腸病學(xué)，2003，8（5）：294-297.

[2] Rehm J，Mathers C，Popova S，et al. Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders[J]. Lancet，2009，373（9682）：2223-2233.

[3] 厲有名. 中國酒精性肝病的研究現(xiàn)狀[J]. 現(xiàn)代消化及介入診療，2007， 12（4）：235-236.

[4] Mandrekar P，Szabo G. Signalling pathways in alcohol-induced liver inflammation[J]. J Hepatol，2009，50（6）：1258-1266.

[5] Ngamkitidechakul C，Jaijoy K，Hansakul P，et al. Antitumour effects of phyllanthus emblica L.：induction of cancer cell apoptosis and inhibition of in vivo tumour promotion and in vitro invasion of human cancer cells[J]. Phytother Res，2010，24（9）：1405-1413.

[6] 李萍，楊政騰，彭百承，等. 余甘子抗大鼠免疫性肝纖維化作用（Ⅰ）[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16（6）：171-173.

[7] 王文光，孔楠，袁唯. 余甘子的功能成分及其綜合利用[J]. 中國食物與營養(yǎng)，2007，12：20-22.

[8] Tipoe GL，Liong EC，Casey CA，et al. A voluntary oral ethanol-feeding rat model associated with necroinflammatory liver injury[J]. Alcohol Clin Exp Res，2008，32（4）：669-682.

[9] 王潤紅. 酒精性肝病的發(fā)病機制和治療[J]. 醫(yī)學(xué)綜述，2001，7（5）：307-309.

[10] Beier JI，McClain CJ. Mechanisms and cell signaling in alcoholic liver disease[J]. Biol Chem，2010，391（11）：1249-1264.

（收稿日期：2011-11-11）