Toll3受體在呼吸道合胞病毒感染中作用的實驗研究

[摘要] 目的 探討呼吸道合胞病毒（RSV）感染人肺上皮A549細胞后，Toll樣受體3（TLR3）的水平變化及其產生的Ⅰ型干擾素的抗病毒作用。 方法 RSV感染體外培養的人肺上皮A549細胞，并給予TLR3特異性抗體處理，分別感染4 h、8 h、12 h、16 h和24 h后收集各組細胞。未感染病毒的細胞作為對照組。RT-PCR法檢測TLR3、IFN-α、IFN-β，RSV F蛋白的mRNA表達水平變化。 結果 RSV感染A549細胞后，TLR3、IFN-α、IFN-β，RSV F蛋白的mRNA表達量均升高且有時間依賴性。 結論 RSV感染A549細胞后可上調TLR3表達，其活化細胞介導產生的Ⅰ型干擾素能起到抗病毒作用。

[關鍵詞] 呼吸道合胞病毒；Toll樣受體3；Ⅰ型干擾素

[中圖分類號] R562 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2012）04-0004-02

Toll-like receptor 3 in the respiratory syncytial virus infection of the experimental study

YANG Baoshun DING Jiafeng

Department of Pediatrics， the First People's Hospital of Wenling City， Zhejiang Province， Wenling 317500， China

[Abstract] Objective To understand the production mechanism of interferon and provide a scientific basis for prevention and clinical therapy. The expression changes of Toll-like receptor (TLR3) mRNA and the role of TLR3 in human lung epithelial cells (A549 cells) infected with respiratory syncytial virus (RSV) were investigated in this study. Methods RSV infected A549 cells were treated with or without specific antibodies of TLR3 and collected at the selected timepoints after RSV infection (4 h， 8 h， 12 h， 16 h and 24 h). The expressions of TLR3， IFN-α， IFN-β and RSV F mRNA were evaluated by RT-PCR. Results It was found that RSV infection could markedly up-regulate the mRNA expression of TLR3. Conclusion Above data indicate that RSV infection could induce an apparent increase of antiviral genes of IFN-α and IFN-β by activating TLR3 in human lung epithelial cells and the activated cells mediated Type I interferon is antiviral， which suggesting that TLR3 might play an important role in antiviralactivity of RSV-infected human lung epithelial cells.

[Key words] Respiratory syncytial virus; Toll-like receptor 3; Type I interferon

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）在引起兒童尤其嬰幼兒急性下呼吸道感染的病原中占主導地位，大約80%的毛細支氣管炎和50%的嬰幼兒肺炎由RSV所致。RSV感染后患兒臨床癥狀較重，可導致呼吸衰竭和心力衰竭等并發癥[1]。另外，RSV感染數月后易出現反復喘息癥狀，甚至發展成為嬰幼兒哮喘。其發病機制可能與RSV感染造成呼吸道上皮細胞損傷、免疫功能紊亂、氣道的神經調節失調有關[2]。目前對RSV感染尚無特殊有效的治療和預防方案，抗炎與抗病毒仍為目前首選的治療方法[3]。RSV為副粘病毒科肺炎病毒屬，Toll樣受體3（Toll-like receptor 3，TLR3）能特異性地識別雙鏈RNA，啟動信號轉導通路誘發級聯反應，RSV在復制和轉錄過程中可產生大量雙鏈RNA[4]。病毒感染時誘導產生的抗炎細胞因子是干擾素（interferon，IFN），不但具有抗病毒作用，而且具有免疫調節的作用。A549細胞是肺腺癌上皮細胞，具有分泌細胞因子和參與免疫調節功能，與RSV融合產生，RSV蛋白（F蛋白），其抗原性穩定，因此，可通過檢測F蛋白的含量，可反映出RSV的增殖狀況[1-3]。本文通過RSV感染肺腺癌上皮細胞（A549），從而探討TLR3活化介導的IFN產生機制及其抗病毒作用，為臨床關于小兒呼吸道RSV感染致病機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與病毒 Hep-2細胞，A549細胞（人肺腺癌上皮細胞），呼吸道合胞病毒（RSV A2）株均為我院中心實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 DEME培養基（Gibco公司，美國）新生牛血清（四季清公司，杭州），羊抗Toll樣受體3抗體（Santa Cruz公司，美國），Trizol試劑（科瑞生物制品有限公司，中國），逆轉錄試劑盒（Toyobo公司，日本），其他試劑均為Sigma產品（美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、病毒擴增與測定 RSV病毒接種Hep-2細胞，37 ℃、50 mL/L CO2培養箱吸附1 h，棄去病毒吸附液；加入20 mL/L DMEM培養基維持培養，置于33 ℃培養箱中培養，第3天取1瓶感染細胞，加入牛抗RSV一抗結合病毒，再加入FITC標記的羊抗牛血清孵育，用顯微鏡檢測細胞內RSV。第5天收獲病毒感染細胞，凍融，離心，取上清病毒液。按Reed-Muench法計算RSV病毒的半數感染量（TCID50）。

1.2.2 細胞實驗分組 將5.0×105的肺腺癌上皮細胞（A549）以2×105細胞/孔接種到6孔板，設復孔，50 mL/L CO2，37℃培養箱培養至80%匯合。實驗分組：感染組（RSV感染組），TLR3抑制組（TLR3+RSV組），正常對照組。

1.2.3 TLR3、IFN-α、IFN-β，RSV F的mRNA表達 RT-PCR檢測各組TLR3、IFN-α、IFN-β，RSV F的mRNA表達水平。各基因的PCR反應條件和循環次數見表1。內參選用β-actin，利用熒光染料進行實時相對熒光定量PCR檢測，用2%瓊脂糖凝膠檢測PCR產物，經凝膠成像分析儀掃描，使用Labworks軟件進行分析。

1.3 統計學處理

采用SPSS11.5軟件包處理數據，數據以（x±s）表示，多個樣本采用單因素方差分析，P ＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TLR3 mRNA在各組中表達與時間的關系

RT-PCR測定結果（圖1），RSV組TLR3 mRNA的表達上調并且有時間依賴性。與正常組對比，RSV組TLR3 mRNA的表達量逐漸增加，感染4 h后TLR3 mRNA也升高，有統計學差異，8 h后有顯著升高，24 h達到最高峰，是基礎表達量5倍以上，升高均有顯著性差異；TLR3+RSV組TLR3 mRNA的表達雖然上調，但較RSV感染組明顯降低，具有顯著性差異。見表2。

2.2 IFN-α mRNA在各組中表達與時間的關系

測定結果表明，正常組中IFN-α mRNA表達基線低，RSV感染組IFN-α mRNA的表達明顯上調并且具有時間依賴性。與正常組比較，RSV感染組IFN-α mRNA的表達量逐漸增加，IFN-α mRNA在感染4 h后開始升高，24 h后達到最高峰；與RSV感染組相比較，TLR3+RSV組，IFN-α mRNA的表達雖然上調，但相對較低具有統計學差異。見表3。

2.3 IFN-β mRNA在各組中表達與時間的關系

A549正常細胞IFN-β mRNA表達基線很低，RSV組IFN-β mRNA的表達上調且有時間依賴性。與正常組對比，RSV感染組IFN-β mRNA的表達量逐漸增加，感染4 h后IFN-β mRNA開始升高，12 h后明顯，24 h后達到最高峰，具有顯著性差異；而TLR3+RSV組，IFN-β mRNA的表達雖然上調，但明顯低于RSV感染組，感染12 h后降低具有統計學意義，24 h后降低具有顯著性差異。見表4。

3 討論

呼吸道合胞病毒（RSV）是造成世界范圍內嬰幼兒下呼吸道感染的首位病毒病原，文獻報道每年全球有6 400萬人感染，有（300～500）萬死亡，65%兒童在1歲內感染，2歲時感染率超過90%，每年約40%～50%住院治療的喘息性支氣管炎及25%肺炎患兒是RSV感染，早產兒、先天性心臟病、支氣管肺發育不良、免疫缺陷病患兒合并RSV感染病情嚴重，嚴重時可導致死亡，同時，RSV感染與哮喘的發生發展密切相關。到目前為止，尚無有效治療和預防方法[5-8]。

Toll樣受體是近年來發現在抗感染及免疫反應起到重要作用的受體蛋白，是細胞跨膜受體，屬于白介素-1受體（IL-1R）超家族成員之一。能識別和啟動不同病原體的相關模式分子（PAMPs），介導先天性免疫和調節適應性免疫應答來抵御病毒的感染[9]。IFNα/β屬I型干擾素，是發揮早期抗病毒和免疫刺激活性的主要效應分子。RSV F蛋白作為第一個被發現的TLR3所識別病毒性PAMP，在抗病毒、阻止病毒復制及保護機體過程中起到重要作用[4]。

本研究證實了RSV感染可顯著上調A 549細胞TLR3和Ⅰ型干擾素的表達，而且其上調作用和RSV感染之間有明顯的時間依賴關系。有文獻研究表明，RSV感染宿主細胞不僅可以使TLR3的表達上調，而且其在被感染的細胞膜上的分布量也有所增加，從而提高了宿主細胞對后來的刺激因素（如病毒、細菌等感染）的反應敏感性。RSV感染細胞后，TLR3與病毒復制和轉錄過程中所形成的dsRNA相結合，上調TLR3的細胞表達，在細胞膜上的分布量增加，反過來進一步與dsRNA結合，形成正反饋性調節[10]。

本研究證實，TLR3抗體能阻斷TLR3活化，從而使RSV F蛋白基因的上調，揭示出TLR3的活化可以抑制RSV在感染中的復制，而達到抗病毒作用?？梢詾榕R床上治療RSV感染及研發抗RSV新藥提供理論基礎。

[參考文獻]

[1] Parker LC，Prince LR，Sabroe I. Translational mini review series on Toll like receptors：networks regulated by Toll like receptors mediate innate and adaptive immunity[J]. Clin Exp Immunol，2007，147：199-207.

[2] Hultcrantz M，Hhn MH，Wolf M，et al. Interferons induce an antiviral state in human pancreatic islet cells[J]. Virology，2007，367（1）：92-101.

[3] Meylan E，Tschopp J. Toll-like receptors and RNA helicases：two parallel ways to trigger antiviral responses[J]. Mol Cell，2006，22（5）：561-569.

[4] 劉菊，楊春，唐安芬，等. 呼吸道合胞病毒Long株的培養及應用[J]. 微生物學雜志，2004，24（5）：47-49.

[5] Spann KM，Tran KC，Chi B，et a1. Suppression of t he induction of alpha，beta，and lambda interferons by the NS1 and NS2 proteins of human respiratory syncytial virus in human epit helial cells and macrophages[J]. J Viro1，2004，78（8）：4363-4369.

[6] 宋卉，錢元恕，董紅梅，等. 頭孢地嗪對中性粒細胞因子分泌的影響[J]. 中國抗生素雜志，2005，30（8）：485-488.

[7] Groskreutz DJ，Monick MM，Powers LS，et al. Respiratory syncytial virusinduces TLR 3 protein and protein kinase R，leading to increased double-stranded RNA responsiveness in airway epit helial cells[J]. J Immunol，2006，176（3）：1733-1740.

[8] 解克芳，牛建昭，王繼峰，等. 姜黃素對人胚肺成纖維細胞的生長抑制及細胞外基質合成的影響[J]. 醫學研究生報，2008，4（4）：339-342.

[9] Schulz O，Diebold SS，Chen M，et al. Toll-like receptor 3 promotes cross-priming to virus-infected cells[J]. Nature，2005，433（7028）：887-892.

[10] 黃升海，劉偉，史曉佾，等. 呼吸道合胞病毒感染巨噬細胞誘導炎性基因表達的部分機制研究[J]. 中國人獸共患病學報，2009，25（10）：948-952.

（收稿日期：2011-09-05）