TGF-β1、CTGF在膽管缺血性損傷修復過程中的表達及意義

[摘要] 目的 探討轉化生長因子β1（TGF-β1）及結締組織生長因子（CTGF）在膽管缺血性損傷修復過程中的表達及意義。 方法 建立大鼠膽管缺血損傷修復模型，隨機分為對照組和實驗組，并分別于術后1、3、5和8周后取材，運用免疫組化技術檢測膽管組織中TGF-β1和CTGF的陽性表達部位，并采用病理圖像分析系統計算膽管缺血性損傷修復過程中各組陽性細胞數。 結果 對照組表現為膠原纖維的平行密集排列，未見明顯的無炎性細胞浸潤；實驗組膠原纖維增生明顯、層次紊亂，疏松結締組織中可見大量毛細血管及炎性細胞浸潤；TGF-β1及CTGF在術后各期均有顯著表達，但術后各期表達對比差異無統計學意義（P ＞ 0.05）；TGF-β1及CTGF在正常對照組無表達或者僅輕微表達，與術后各期TGF-β1及CTGF表達比較差異有統計學意義（P ＜ 0.01）；Spearman相關分析：實驗組術后各期TGF-β1和CTGF的表達呈正相關性。 結論 TGF-β1和CTGF在膽管缺血損傷修復過程中相伴表達且與良性膽管狹窄的形成密切相關，為防治瘢痕增生和良性膽管狹窄提供了一條新的思路和途徑。

[關鍵詞] 損傷修復；膽管狹窄；轉化生長因子β1；結締組織生長因子

[中圖分類號] R657.4+6 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2012）04-0006-03

Expression and significance of TGF-β1 and CTGF in the repairing process of bile duct ischemic injury

WANG Yong1 WANG Xiangyu2 LI Lijun2 HU Chunlei2 GAO Feng1

1.Department of General Surgery， the Third People’s Hospital of Ouhai District of Wenzhou， Wenzhou 325014， China; 2.Department of Hepatobiliary Surgery， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To explore the expression and significance of transforming growth factor β1 (TGF-β1) and connective tissue growth factor (CTGF) in the repairing process of biliary ischemic injury. Methods Rat bile duct ischemia injury and repair modes were established and randomly divided into control group and experimental group， and after operation respectively 1， 3， 5 and 8 weeks after sampling， using immunohistochemical techniques for the detection of bile duct tissue TGF-β1 and the positive expression of CTGF site， and the use of image analysis system to calculate the number of positive cells of the bile duct ischemia injury repair process in each group. Results The control group showed collagen fibers parallel arranged densely， no obvious without inflammatory cell infiltration; experimental groups of collagen fibers proliferated markedly， levels of disturbance， loose connective tissue revealed numerous capillaries and infiltration of inflammatory cells; TGF β1 and CTGF in postoperative periods were significantly expressed， but after the voicing contrast there was no significant difference (P ＞ 0.05); TGF β1 and CTGF in normal control group without expression or only minor expression， and postoperative periods comparison of TGF β1 and CTGF expression in the presence of significant difference (P ＜ 0.01); Spearman analysis: TGF β1 and CTGF expression were positively correlated in experimental group after the period of Surgery. Conclusion TGF β1 and CTGF in bile duct ischemia injury during repair process are concomitantly expressed， and is closely related to benign bile duct stricture formation， and provides a new train of thought and way for the prevention of scar hyperplasia and benign bile duct strictures.

[Key words] Damage repair; Bile duct stricture; Transforming growth factor β1; Connective tissue growth factor

良性膽管狹窄（benign biliary stricture，BBS）是由手術創傷而非腫瘤因素引起的膽管管腔纖維組織增生、瘢痕攣縮[1]。隨著膽道外科的發展，腹腔鏡膽囊切除術在各級醫院得到廣泛開展，隨之而來的膽管缺血性損傷越來越多，進而導致較高的BBS發生率。據報道，膽管缺血性損傷發生率約占臨床膽道疾病的10%～20%[2]。BBS發生后治療困難且處理不當會引起嚴重的并發癥，預后較差。臨床研究發現，肝外膽管缺血性損傷是造成BBS發生的主要因素，但其發病機制卻尚不清楚。TGF-β1是目前已知與瘢痕形成關系最密切、最有代表性的生長因子；CTGF是一種新發現的促成纖維細胞分裂和膠原沉積的生長因子，亦與瘢痕發生發展密切相關[3，4]。本課題旨在通過建立大鼠肝外膽管缺血性損傷模型，檢測TGF-β1、CTGF在膽管缺血性損傷修復過程中的表達，探討膽管缺血性損傷引起BBS的機制及TGF-β1、CTGF在良性膽管狹窄形成過程中的作用，為尋求良性膽管狹窄的治療提供一條新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

SPF級SD雄性大鼠100只（溫州醫學院實驗動物中心提供），體重150～200 g；TGF-β1多克隆抗體（Santa Cruz公司）；羊抗兔IgG多抗、兔抗羊IgG多抗（上海史瑞可生物科技有限公司）；5%～10%羊血清；PBS；羊抗鼠CTGF多抗（美國PeproTech公司）。

1.2 方法

100只SPF級SD大鼠隨機分為對照組及實驗組，實驗組根據術后處理時間不同分為4個亞組（術后1、3、5、8周處理組），每組20只。實驗組用2枚顯微血管夾（寬0.2 cm）夾閉十二指腸上緣長約0.4 cm的膽總管90 min，對照組僅暴露膽總管未夾閉。對照組于術后1周取膽總管組織，實驗組于術后1、3、5、8周取夾閉處中間膽總管組織，石蠟包埋，行HE及VG（苦味酸-酸性品紅法）染色，觀察其病理改變；免疫組化技術檢測兩組膽管組織中TGF-β1、CTGF的陽性表達部位，并采用病理圖像分析系統計算陽性細胞數。

1.3 免疫組化評定標準

細胞質或核內見淡黃色顆粒為陽性細胞。細胞著色強度分級：“-”為陰性細胞；“+”為細胞核和/或質染成淡棕黃色；“+++”為深棕黃色，“++”則介于兩者之間。每張切片高倍鏡下（×400）隨機選取5個視野，計數每個視野陽性細胞數，取其均數進行定量分析[5]。

1.4 統計學方法

數據采用SPSS 16.0軟件作統計學處理，TGF-β1和CTGF陽性表達細胞的數量相關性采用Spearman秩相關分析，P ＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膽管膠原纖維結構變化

VG染色鏡下膠原纖維呈紅色，對照組分布稀疏，纖維較細；實驗組各期膠原纖維粗大，密集成束。見圖1。

A：對照組；B~D：術后1、3、7周組

2.2 免疫組化檢測結果

TGF-β1及CTGF在術后各期均有顯著表達，但術后各期表達比較差異無統計學意義（P ＞ 0.05）；TGF-β1及CTGF在正常對照組無表達或者僅輕微表達，與術后各期比較TGF-β1及CTGF表達差異有統計學意義（P ＜ 0.01）；Spearman相關分析：實驗組術后各期TGF-β1和CTGF的表達呈正相關性，隨著手術時間的延長，兩者均有遞增趨勢，見圖2、圖3，TGF-β1與CTGF表達相關性見表1。

注：實驗組TGF-β1與CTGF的表達與對照組比較，差異有統計學意義（*P ＜ 0.01，**P ＜ 0.01）；實驗組組間TGF-β1與CTGF的表達差異無統計學意義（P ＞ 0.05）；Spearman相關分析：實驗組TGF-β1和CTGF的表達呈正相關（r = 0.246，P ＜ 0.05）

3 討論

國內外研究表明，膽管損傷時所造成的膽管缺血狹窄涉及多種細胞、細胞因子和細胞外基質之間錯綜復雜的相互作用[6，7]。本實驗采用鉗夾法建立了大鼠膽管缺血狹窄模型[8]。結果顯示正常對照組大鼠TGF-β1及CTGF無表達或者輕微表達，與術后各期比較TGF-β1及CTGF表達差異有統計學意義（P ＜ 0.05）；實驗組疏松結締組織中可見大量毛細血管及炎性細胞浸潤，而對照組未見明顯的炎性細胞浸潤。提示TGF-β1、CTGF是由術中產生的大量炎性細胞合成分泌。另外實驗組術后出現大量的炎性細胞浸潤，提示慢性炎癥亦是膽管瘢痕狹窄的重要因素。

TGF-β1與瘢痕形成密切相關，是一種所占比例最高、活性最強、最有代表性的生長因子[9]。本實驗過程中，膽管愈合的1、3、5、8周TGF-β1均表現為局部持續較高濃度表達，而正常對照組TGF-β1無表達或僅輕微表達，實驗進一步證明TGF-β1可能是膽管瘢痕增生的主要原因；CTGF是新發現的在纖維化病程中發揮重要作用的生長因子，能促使Ⅰ型和Ⅲ型膠原的合成，被認為是其他分子誘導的生物學作用的調節者和輔助介導因素。本實驗過程中，膽管愈合的1、3周CTGF明顯表達，膽管愈合的5、8周則表現為持續的強表達，而正常對照組CTGF無表達或僅輕微表達，從而證明CTGF亦是膽管瘢痕增生的重要原因；Spearman相關分析可得，TGF-β1、CTGF在實驗組術后各期呈正相關表達，隨著手術時間的延長，兩者均表現為持續增強表達。

綜上所述，細胞因子TGF-β1、CTGF在膽管缺血引起膽管狹窄過程中發揮著重要作用，是膽管狹窄形成的主要因素；其次，實驗證明炎性細胞浸潤亦是膽管缺血引起膽管狹窄過程的重要影響因素[10]。可見，TGF-β1、CTGF的持續高表達及大量的炎性細胞浸潤是膽管缺血引起膽管狹窄的主要病理機制。因此，設法抑制TGF-β1、CTGF的過度表達及活性，減少炎癥反應的量和程度，將有助于預防和減少術后膽管瘢痕增生和管腔狹窄的發生，對防治良性膽管狹窄提供了一條新的思路和途徑。

[參考文獻]

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[6] 耿智敏，張曉雪，王林，等. 良性膽管狹窄組織中CTGF表達的意義[J]. 第四軍醫大學學報，2007，28（21）：1951-1953.

[7] 何中林，陳平，閆洪濤，等. 膽汁刺激與良性膽管狹窄形成機制的試驗研究[J]. 重慶醫學，2008，37（15）：1699-1700.

[8] 耿智敏，向國安，韓慶，等. 良性膽管狹窄形成機制的實驗研究[J]. 中華肝膽外科雜志，2001，7（10）：618-620.

[9] 王林，張曉雪，耿智敏. 良性膽管狹窄組織中TGF-β1及TβRⅠ的表達意義[J]. 第四軍醫大學學報，2007，28（1）：45-47.

[10] 楊鴻煒，鄒浩，吳濤，等. 良性膽管瘢痕組織中VEGF表達和微血管密度研究[J]. 昆明醫學院學報，2008，29（6）：117-121.

（收稿日期：2011-11-17）