TGF-β1、CTGF在膽管缺血性損傷修復(fù)過(guò)程中的表達(dá)及意義

[摘要] 目的 探討轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）及結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）在膽管缺血性損傷修復(fù)過(guò)程中的表達(dá)及意義。 方法 建立大鼠膽管缺血損傷修復(fù)模型，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，并分別于術(shù)后1、3、5和8周后取材，運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)膽管組織中TGF-β1和CTGF的陽(yáng)性表達(dá)部位，并采用病理圖像分析系統(tǒng)計(jì)算膽管缺血性損傷修復(fù)過(guò)程中各組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。 結(jié)果 對(duì)照組表現(xiàn)為膠原纖維的平行密集排列，未見明顯的無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；實(shí)驗(yàn)組膠原纖維增生明顯、層次紊亂，疏松結(jié)締組織中可見大量毛細(xì)血管及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；TGF-β1及CTGF在術(shù)后各期均有顯著表達(dá)，但術(shù)后各期表達(dá)對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）；TGF-β1及CTGF在正常對(duì)照組無(wú)表達(dá)或者僅輕微表達(dá)，與術(shù)后各期TGF-β1及CTGF表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）；Spearman相關(guān)分析：實(shí)驗(yàn)組術(shù)后各期TGF-β1和CTGF的表達(dá)呈正相關(guān)性。 結(jié)論 TGF-β1和CTGF在膽管缺血損傷修復(fù)過(guò)程中相伴表達(dá)且與良性膽管狹窄的形成密切相關(guān)，為防治瘢痕增生和良性膽管狹窄提供了一條新的思路和途徑。

[關(guān)鍵詞] 損傷修復(fù)；膽管狹窄；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；結(jié)締組織生長(zhǎng)因子

[中圖分類號(hào)] R657.4+6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2012）04-0006-03

Expression and significance of TGF-β1 and CTGF in the repairing process of bile duct ischemic injury

WANG Yong1 WANG Xiangyu2 LI Lijun2 HU Chunlei2 GAO Feng1

1.Department of General Surgery， the Third People’s Hospital of Ouhai District of Wenzhou， Wenzhou 325014， China; 2.Department of Hepatobiliary Surgery， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To explore the expression and significance of transforming growth factor β1 (TGF-β1) and connective tissue growth factor (CTGF) in the repairing process of biliary ischemic injury. Methods Rat bile duct ischemia injury and repair modes were established and randomly divided into control group and experimental group， and after operation respectively 1， 3， 5 and 8 weeks after sampling， using immunohistochemical techniques for the detection of bile duct tissue TGF-β1 and the positive expression of CTGF site， and the use of image analysis system to calculate the number of positive cells of the bile duct ischemia injury repair process in each group. Results The control group showed collagen fibers parallel arranged densely， no obvious without inflammatory cell infiltration; experimental groups of collagen fibers proliferated markedly， levels of disturbance， loose connective tissue revealed numerous capillaries and infiltration of inflammatory cells; TGF β1 and CTGF in postoperative periods were significantly expressed， but after the voicing contrast there was no significant difference (P ＞ 0.05); TGF β1 and CTGF in normal control group without expression or only minor expression， and postoperative periods comparison of TGF β1 and CTGF expression in the presence of significant difference (P ＜ 0.01); Spearman analysis: TGF β1 and CTGF expression were positively correlated in experimental group after the period of Surgery. Conclusion TGF β1 and CTGF in bile duct ischemia injury during repair process are concomitantly expressed， and is closely related to benign bile duct stricture formation， and provides a new train of thought and way for the prevention of scar hyperplasia and benign bile duct strictures.

[Key words] Damage repair; Bile duct stricture; Transforming growth factor β1; Connective tissue growth factor

良性膽管狹窄（benign biliary stricture，BBS）是由手術(shù)創(chuàng)傷而非腫瘤因素引起的膽管管腔纖維組織增生、瘢痕攣縮[1]。隨著膽道外科的發(fā)展，腹腔鏡膽囊切除術(shù)在各級(jí)醫(yī)院得到廣泛開展，隨之而來(lái)的膽管缺血性損傷越來(lái)越多，進(jìn)而導(dǎo)致較高的BBS發(fā)生率。據(jù)報(bào)道，膽管缺血性損傷發(fā)生率約占臨床膽道疾病的10%～20%[2]。BBS發(fā)生后治療困難且處理不當(dāng)會(huì)引起嚴(yán)重的并發(fā)癥，預(yù)后較差。臨床研究發(fā)現(xiàn)，肝外膽管缺血性損傷是造成BBS發(fā)生的主要因素，但其發(fā)病機(jī)制卻尚不清楚。TGF-β1是目前已知與瘢痕形成關(guān)系最密切、最有代表性的生長(zhǎng)因子；CTGF是一種新發(fā)現(xiàn)的促成纖維細(xì)胞分裂和膠原沉積的生長(zhǎng)因子，亦與瘢痕發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3，4]。本課題旨在通過(guò)建立大鼠肝外膽管缺血性損傷模型，檢測(cè)TGF-β1、CTGF在膽管缺血性損傷修復(fù)過(guò)程中的表達(dá)，探討膽管缺血性損傷引起B(yǎng)BS的機(jī)制及TGF-β1、CTGF在良性膽管狹窄形成過(guò)程中的作用，為尋求良性膽管狹窄的治療提供一條新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

SPF級(jí)SD雄性大鼠100只（溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體重150～200 g；TGF-β1多克隆抗體（Santa Cruz公司）；羊抗兔IgG多抗、兔抗羊IgG多抗（上海史瑞可生物科技有限公司）；5%～10%羊血清；PBS；羊抗鼠CTGF多抗（美國(guó)PeproTech公司）。

1.2 方法

100只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組根據(jù)術(shù)后處理時(shí)間不同分為4個(gè)亞組（術(shù)后1、3、5、8周處理組），每組20只。實(shí)驗(yàn)組用2枚顯微血管夾（寬0.2 cm）夾閉十二指腸上緣長(zhǎng)約0.4 cm的膽總管90 min，對(duì)照組僅暴露膽總管未夾閉。對(duì)照組于術(shù)后1周取膽總管組織，實(shí)驗(yàn)組于術(shù)后1、3、5、8周取夾閉處中間膽總管組織，石蠟包埋，行HE及VG（苦味酸-酸性品紅法）染色，觀察其病理改變；免疫組化技術(shù)檢測(cè)兩組膽管組織中TGF-β1、CTGF的陽(yáng)性表達(dá)部位，并采用病理圖像分析系統(tǒng)計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.3 免疫組化評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

細(xì)胞質(zhì)或核內(nèi)見淡黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。細(xì)胞著色強(qiáng)度分級(jí)：“-”為陰性細(xì)胞；“+”為細(xì)胞核和/或質(zhì)染成淡棕黃色；“+++”為深棕黃色，“++”則介于兩者之間。每張切片高倍鏡下（×400）隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其均數(shù)進(jìn)行定量分析[5]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，TGF-β1和CTGF陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膽管膠原纖維結(jié)構(gòu)變化

VG染色鏡下膠原纖維呈紅色，對(duì)照組分布稀疏，纖維較細(xì)；實(shí)驗(yàn)組各期膠原纖維粗大，密集成束。見圖1。

A：對(duì)照組；B~D：術(shù)后1、3、7周組

2.2 免疫組化檢測(cè)結(jié)果

TGF-β1及CTGF在術(shù)后各期均有顯著表達(dá)，但術(shù)后各期表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）；TGF-β1及CTGF在正常對(duì)照組無(wú)表達(dá)或者僅輕微表達(dá)，與術(shù)后各期比較TGF-β1及CTGF表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）；Spearman相關(guān)分析：實(shí)驗(yàn)組術(shù)后各期TGF-β1和CTGF的表達(dá)呈正相關(guān)性，隨著手術(shù)時(shí)間的延長(zhǎng)，兩者均有遞增趨勢(shì)，見圖2、圖3，TGF-β1與CTGF表達(dá)相關(guān)性見表1。

注：實(shí)驗(yàn)組TGF-β1與CTGF的表達(dá)與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P ＜ 0.01，**P ＜ 0.01）；實(shí)驗(yàn)組組間TGF-β1與CTGF的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）；Spearman相關(guān)分析：實(shí)驗(yàn)組TGF-β1和CTGF的表達(dá)呈正相關(guān)（r = 0.246，P ＜ 0.05）

3 討論

國(guó)內(nèi)外研究表明，膽管損傷時(shí)所造成的膽管缺血狹窄涉及多種細(xì)胞、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)之間錯(cuò)綜復(fù)雜的相互作用[6，7]。本實(shí)驗(yàn)采用鉗夾法建立了大鼠膽管缺血狹窄模型[8]。結(jié)果顯示正常對(duì)照組大鼠TGF-β1及CTGF無(wú)表達(dá)或者輕微表達(dá)，與術(shù)后各期比較TGF-β1及CTGF表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）；實(shí)驗(yàn)組疏松結(jié)締組織中可見大量毛細(xì)血管及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而對(duì)照組未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。提示TGF-β1、CTGF是由術(shù)中產(chǎn)生的大量炎性細(xì)胞合成分泌。另外實(shí)驗(yàn)組術(shù)后出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示慢性炎癥亦是膽管瘢痕狹窄的重要因素。

TGF-β1與瘢痕形成密切相關(guān)，是一種所占比例最高、活性最強(qiáng)、最有代表性的生長(zhǎng)因子[9]。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，膽管愈合的1、3、5、8周TGF-β1均表現(xiàn)為局部持續(xù)較高濃度表達(dá)，而正常對(duì)照組TGF-β1無(wú)表達(dá)或僅輕微表達(dá)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明TGF-β1可能是膽管瘢痕增生的主要原因；CTGF是新發(fā)現(xiàn)的在纖維化病程中發(fā)揮重要作用的生長(zhǎng)因子，能促使Ⅰ型和Ⅲ型膠原的合成，被認(rèn)為是其他分子誘導(dǎo)的生物學(xué)作用的調(diào)節(jié)者和輔助介導(dǎo)因素。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，膽管愈合的1、3周CTGF明顯表達(dá)，膽管愈合的5、8周則表現(xiàn)為持續(xù)的強(qiáng)表達(dá)，而正常對(duì)照組CTGF無(wú)表達(dá)或僅輕微表達(dá)，從而證明CTGF亦是膽管瘢痕增生的重要原因；Spearman相關(guān)分析可得，TGF-β1、CTGF在實(shí)驗(yàn)組術(shù)后各期呈正相關(guān)表達(dá)，隨著手術(shù)時(shí)間的延長(zhǎng)，兩者均表現(xiàn)為持續(xù)增強(qiáng)表達(dá)。

綜上所述，細(xì)胞因子TGF-β1、CTGF在膽管缺血引起膽管狹窄過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，是膽管狹窄形成的主要因素；其次，實(shí)驗(yàn)證明炎性細(xì)胞浸潤(rùn)亦是膽管缺血引起膽管狹窄過(guò)程的重要影響因素[10]。可見，TGF-β1、CTGF的持續(xù)高表達(dá)及大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)是膽管缺血引起膽管狹窄的主要病理機(jī)制。因此，設(shè)法抑制TGF-β1、CTGF的過(guò)度表達(dá)及活性，減少炎癥反應(yīng)的量和程度，將有助于預(yù)防和減少術(shù)后膽管瘢痕增生和管腔狹窄的發(fā)生，對(duì)防治良性膽管狹窄提供了一條新的思路和途徑。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 趙德芳，張彤，趙利軍，等. 大鼠膽管缺血狹窄模型的構(gòu)建[J]. 中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（18）：3351-3353.

[2] 王向昱，李立軍，鄭志強(qiáng). 良性膽管狹窄發(fā)生的分子學(xué)機(jī)制及生物治療[J]. 中華肝膽外科雜志，2011，17（6）：518-520.

[3] 陶靈，李世榮，劉劍毅，等. CTGF刺激人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞STATs蛋白活化的狀況[J]. 中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2008，17（4）：521-523.

[4] 李立軍，王向昱，張普，等. TGF-β1及CTGF在膽管缺血性損傷修復(fù)過(guò)程中的表達(dá)及意義[J]. 肝膽胰外科雜志，2011，23（4）：336-339.

[5] 耿智敏，徐軍，劉青光，等. 良性膽管狹窄形成機(jī)制的研究[J]. 消化外科，2002，1（5）：321-323.

[6] 耿智敏，張曉雪，王林，等. 良性膽管狹窄組織中CTGF表達(dá)的意義[J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28（21）：1951-1953.

[7] 何中林，陳平，閆洪濤，等. 膽汁刺激與良性膽管狹窄形成機(jī)制的試驗(yàn)研究[J]. 重慶醫(yī)學(xué)，2008，37（15）：1699-1700.

[8] 耿智敏，向國(guó)安，韓慶，等. 良性膽管狹窄形成機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中華肝膽外科雜志，2001，7（10）：618-620.

[9] 王林，張曉雪，耿智敏. 良性膽管狹窄組織中TGF-β1及TβRⅠ的表達(dá)意義[J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28（1）：45-47.

[10] 楊鴻煒，鄒浩，吳濤，等. 良性膽管瘢痕組織中VEGF表達(dá)和微血管密度研究[J]. 昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，29（6）：117-121.

（收稿日期：2011-11-17）