糖肝康對糖尿病脂肪肝模型大鼠肝臟Obestatin mRNA表達的影響*

錢秋海， 郭春芳， 錢衛斌， 蔡欣蕊， 姜群群， 張新穎

(1.山東中醫藥大學附屬醫院內分泌科， 山東 濟南 250011； 2.山東省禹城市人民醫院， 山東 禹城 251200；3.山東中醫藥大學 第一臨床醫學院， 山東 濟南 250014)

糖尿病脂肪肝以糖尿病和肝臟結構異常并存為主要臨床特征，是嚴重影響糖尿病患者身體健康的常見病。近年來，隨著糖尿病發病率的急劇增高，糖尿病脂肪肝的發病率顯著增高。糖尿病脂肪肝一旦發生，既可出現肝臟脂肪沉積、肝功能異常，又會增加胰島素抵抗，使糖尿病更難控制。肥胖抑制素(Obestatin)是2005年從大鼠胃組織中分離的一種Ghrelin相關肽，因其與肥胖、胃腸動力疾病、糖尿病可能存在密切關系，已成為研究的熱點。本實驗以Obestatin為切入點，觀察糖肝康對糖尿病脂肪肝模型大鼠肝臟組織中Obestatin mRNA表達的影響并分析，報道如下。

1 實驗材料

1.1 動物及飼料 健康雄性SD大鼠60只，體質量(200±20)g，由山東中醫藥大學試驗動物中心提供，動物合格證號：SCXR(魯)2005015。常規飼料由山東省實驗動物中心提供。高糖高脂飼料(清潔級)由北京科澳協力飼料有限公司提供(配方：10.0%豬油，20.0%蔗糖，10.0%蛋黃粉，0.5%膽酸鈉和59.5%常規飼料。)

1.2 藥品及試劑

1.2.1 觀察用藥 糖肝康(生黃芪、白術、茵陳、黃芩、柴胡、炒梔子、丹參、大黃等)：山東中醫藥大學附屬醫院藥房提供，實驗時制成糖肝康濃縮煎劑，濃度為1.87 g/mL及3.75 g/mL。

1.2.2 對照用藥 降糖甲片，吉林敖東制藥有限公司提供，生產批號：090314。給藥時配成降糖甲混懸液，濃度約5.6 g/mL。

1.2.3 動物模型用藥 鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)：美國Sigma公司生產，北京博愛港商貿有限公司提供。

1.2.4 RT-PCR所用試劑 超純總RNA提取試劑盒，北京康為世紀生物科技有限公司；ReverTra Ace qPCR RT kit，Transgene PCR Mix，日本TOYOBO公司；15DL2000 DNA marker，日本TAKARA公司；氯仿分析純，異丙醇，無水乙醇，無RNAase 水等。

1.3 實驗儀器 eppendoff 普通高速離心機(5415D型，Centrifuge公司)；PCR儀(PTC-200 Peltier Thermal Cycler，美國PE公司)；Alpha Imager TM 2200 凝膠成像系統(Alpha Innotech 公司)；Bio Rad 電泳儀及電泳槽(北京東方恒偉科技開發公司)；移液器(Gilson 產品)，Axygen無RNA酶槍頭及eppendorf管等。

2 實驗方法

2.1 造模方法 SD大鼠50只，給予普通飼料、自由飲水，適應性飼養3 d后，改高糖高脂飼料喂養，6周后，禁食12 h，斷尾取血并用美國強生血糖儀測空腹血糖。按30 mg/kg體重的劑量腹腔內注射新鮮配制的2%鏈脲佐菌素(檸檬酸緩沖液，PH4.2)。72 h后尾靜脈取血測血糖，血糖高于16.7 mmol/L者確定為糖尿病模型制作成功。選取40只大鼠進入實驗。

2.2 分組及給藥 將40只糖尿病大鼠隨即分為4組(n=10)：①模型對照組，②糖肝康小劑量組，③糖肝康大劑量組，④降糖甲對照組，每組10只。其中，模型對照組予生理鹽水10 mL/kg灌胃；糖肝康小劑量組予濃度為1.87 g/mL的糖肝康灌胃；糖肝康大劑量組予濃度為3.75 g/mL的糖肝康灌胃；降糖甲對照組予降糖甲混懸液56 g/kg灌胃。實驗各組均給藥容積為10 mL/kg，每日灌胃1次，高脂飼料飲食，正常飲水。另取10只正常大鼠作為正常對照組，每日10 mL/kg生理鹽水灌胃，并予正常飼料飲食，正常飲水。室溫18～20 ℃，12 h交替照明。連續給藥12周。

2.3 組織標本的采集 給藥觀察12周后，斷尾取血檢測各組動物空腹血糖(取血前禁食8 h)。然后用戊巴比妥鈉30 mg·kg-1腹腔注射麻醉，開腹取出肝臟，用生理鹽水沖洗后，放入-80℃冰箱備用。

2.4 RT-PCR法檢測Obestatin

2.4.1 總RNA提取 按康為超純總RNA提取試劑盒(CW0581)說明書進行。100 mg組織經液氮研磨，加入1 mLTLbuffer，室溫放置5min，讓組織完全裂解。加200 uL氯仿，充分vortex15s，室溫放置2～3 min，12000 rpm離心15 min。將上清轉移到新的Eppendorf管內。加等量的無水乙醇，混勻，將混合物加到離心柱上，12 000rpm離心30 s，加PW 1 700 uL，12 000 rpm離心30 s，加PW2 500 uL2次，12 000 rpm離心30 s，14 000 rpm離心2 min，加預熱的DEPC水50 uL，室溫放置2～3 min，12 000 rpm離心30 s收集RNA。RNA定量：SMA-1000測定RNA濃度，將濃度調整到一致。

2.4.2 RT-PCR反應檢測Obestatin mRNA表達

PCR程序：94 ℃3 min，94 ℃ 30 s，60 ℃30 s，72 ℃1 min，35個循環，72 ℃5 min。

大鼠β-actin 上游引物：5’-GAG GGA AAT CGT GCG TGA C-3’，

大鼠β-actin下游引物：5’-GGA CTC ATC GTA CTC CTG CTT G-3，

擴增產物：481bp

大鼠-Obestatin上游引物：5’-ATG GTG TCT TCA GCG ACT ATC T-3’

大鼠-Obestatin下游引物：5’ -CTC TGC TGG GCT TTC TGG-3’

擴增產物：113 bp

2.4.3 電泳及數據分析 1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染料。Alpha Innotech imager觀察電泳條帶存入圖象，β-actin的產物為481bp，Obestatin的產物為113bp。以系統的SPOT DENSITY 軟件分別測量內參照和Obestatin基因擴增條帶的密度，以Obestatin條帶的密度與內參照管家基因的密度比值代表基因表達的相對水平。

4 統計方法

5 實驗結果

RT-PCR結果顯示：模型對照組大鼠肝臟組織中Obestatin mRNA表達水平較空白對照組明顯升高(P<0.05)；糖肝康大、小劑量組在給藥12周后，肝臟組織中Obestatin mRNA表達較模型對照組減少，有顯著性差異(P<0.05)，且效果優于降糖甲對照組。見圖1及表1。

圖1 糖肝康對模型大鼠肝臟Obestatin mRNA表達的影響

注：M：空白對照組；A：空白對照組；B：模型對照組；C：降糖甲對照組；D：糖肝康小劑量組；E：糖肝康大劑量組

表1 糖肝康對模型大鼠肝臟Obestatin mRNA表達的影響

與空白對照組相比，aP<0.05，bP<0.01；與模型對照組相比，cP<0.05，dP<0.01.

6 討論

近年來，隨著糖尿病發病率的急劇增高，糖尿病并發脂肪肝的發病率也有顯著增高的趨勢。據文獻報道糖尿病肝損害的發生率為10%～30%。糖尿病脂肪肝的存在使糖尿病的治療難度加大，并直接影響糖尿病的療效和預后。如果能夠及早的發現糖尿病脂肪肝并做到有效的防治，對于提高糖尿病患者的生活質量具有重大意義。因此，對糖尿病脂肪肝的研究，正在逐步引起醫學界的重視。

肥胖抑制素(Obestatin)是2005年[1]從大鼠胃組織中分離的一種Ghrelin相關肽，他可以結合孤兒G蛋白偶聯受體GPR39，產生與Ghrelin相反的作用。廣泛分布于大鼠的胃黏膜細胞、腸神經節細胞、睪丸問質細胞[2]、十二指腸、空腸、結腸、胰腺[3]、以及人的唾液和唾液腺[4]中。Obestatin具有非常廣泛的生物學功能，可負向調節攝食和胃腸運動外[1]，也可作用于胰腺胰島組織抑制胰島素、胰多肽、生長抑素等的分泌[5]。齊曉婭比較了糖調節受損和2型糖尿病患者血漿Obestatin水平變化，結果顯示血漿Obestatin水平與體重指數、葡萄糖負荷后2 h血糖、糖化血紅蛋白、腰臀比、空腹胰島素和胰島素抵抗指數呈明顯負相關，低Obestatin水平與胰島素抵抗和2型糖尿病的發生密切相關[6]。另有研究表明obestatin與各種糖、脂代謝因素亦密切相關[7]。

本研究以肝臟組織中Obestatin的mRNA表達為切入點，分析糖尿病脂肪肝的發病機制及糖肝康對其的干預作用。結果證實：Obestatin mRNA在肝臟中表達較少。造模后大鼠的肝臟組織中Obestatin mRNA表達水平較正常大鼠升高。以健脾益氣、調肝解毒活血為組方原則研制的糖肝康對模型大鼠肝臟組織Obestatin mRNA表達有抑制作用。表明糖尿病脂肪肝患者的糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗可能與Obestatin的異常表達相關，糖肝康可通過調節Obestatin mRNA表達，在糖、脂代謝、胰島素敏感度等方面起作用，值得進一步深入研究。

[1]Zhang JV，Ren PG，Avsian-Kretchrner O，Luo CW，Rauch R，Klein C，Hsueh AJ.Obestatin，a peptide encoded by the ghrelin gene，opposes ghrelin`s effects on food intake.Science 2005；310：996～999.

[2]Ozbay Y，Aydin S，Dagli AF，Akbulut M，Dagli N，Kilic N，Rahman A，Sahin I，Polat V，Ozercan HI，Arslan N Sensoy D.Obestatin is present in saliva：alterations in obestatin and ghrelin levels of saliva and serum in ischemic heart disease.BMB Rep 2008；41：55～61.

[3]Aydin S，Ozkan Y，Erm an F，Gurates B，Kilic N，Colak R，Gundogan T，Catak Z，Bozkurt M，Akin O，Sen Y，Sahn I.Presence of obestatin in breast milk：relationship among obestatin，ghrelin.and leptin in lactating women.Nutrition 2008；24：689～693.

[4]Fujimiya M，Ataka K，Asakawa A，Inui A.Obestatin inhibits gastroduodenal motility in conscious fed rats via POMC pathway and CRF receptors in the brain.Autonomic Neuroscience 2007；135：41.

[5]Ataka K，Inui A，Asakawa A，Kato I，Fujimiya M.Obestatin inhibits motor activity in the antrum and duodenum in the fed state of conscious rats.Am[J]，Physiol Gastrointest Liver Physiol 2008；294：G1210～G1218.

[6]齊曉婭，楊剛毅，劉石紹，等.糖調節受損和2型糖尿病患者血漿obestatin水平降低[J].中華內分泌代謝雜志，2007，23(6)：535～536.

[7]徐海蓉，鄭興，郭志福.單純性肥胖癥患者外周血ghrelin、obestatin的水平變化及其臨床意義[J].心臟雜志，2009，21(1)：95～98.