桑蟬止咳方提取工藝初步試驗(yàn)研究*

徐靜逍, 羅曉麗, 李晉玉, 崔 濤, 畢 云, 熊麗娟

(1.云南中醫(yī)學(xué)院, 云南 昆明 650500； 2.云南省藥物研究所, 云南 昆明 650101； 3.昆明醫(yī)學(xué)院, 云南 昆明 650031)

桑蟬止咳方由桑葉、木蝴蝶等組成，具有疏散風(fēng)熱，利咽止咳等功效，為治療燥熱型咳嗽的有效經(jīng)驗(yàn)方，其活性成分大多溶于乙醇和水，因此筆者選用醇-水雙提法以達(dá)到能最大限度提取方中有效成分的目的。本實(shí)驗(yàn)主要研究醇提部分的提取工藝，用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)影響提取工藝的醇濃度、醇用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)等因素進(jìn)行考察，以桑葉中的蘆丁、木蝴蝶中的黃芩苷的轉(zhuǎn)移率為工藝考察指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算影響該試驗(yàn)的主次因素，再結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際確定優(yōu)化的工藝參數(shù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters1525色譜儀Agilent 1200。

1.2 試藥

1.2.1 試劑 提取用的乙醇為醫(yī)用乙醇，含量測(cè)定用的甲醇、乙腈、均為色譜純，冰乙酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、磷酸(重慶川東有限公司化學(xué)試劑廠)醋酸銨(上海試四赫維化工有限公司)均為分析純，配制溶劑用的水為自制超純水。

1.2.2 對(duì)照品 綠原酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110753-200212)，黃芩苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110715-200815)。

1.2.3 藥材 該提取工藝所用桑葉、木蝴蝶等藥材均購(gòu)于云南省藥材公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 醇提部分的正交實(shí)驗(yàn)

2.1.1 醇提正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)前述各味藥材所含成分及藥理研究基礎(chǔ)，按處方量稱取藥材，選取影響提取的幾個(gè)主要因素醇濃度、醇用量、提取次數(shù)、提取時(shí)間為考察因素，每個(gè)因素設(shè)立如下表1的3個(gè)水平。

采用L9(34)正交表安排實(shí)驗(yàn)，按正交條件進(jìn)行乙醇回流提取，濾過(guò)，濾液回收乙醇后再濃縮至小體積，置于水浴鍋上烘至稠浸膏后置于真空烘箱中烘干。

2.1.2 各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定方法 醇提干浸膏得率：按處方量稱取藥材，以L9(34)正交表設(shè)計(jì)的順序各加入設(shè)定的乙醇用量，按規(guī)定的時(shí)間和次數(shù)回流提取，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇后濃縮成浸膏，置真空烘箱中減壓干燥至干浸膏，稱重計(jì)算干浸膏得率。

綠原酸、黃芩苷含量的測(cè)定：照高效液相色譜法(《中國(guó)藥典》2005版一部附錄Ⅵ D)測(cè)定[1]。

2.1.3 高效液相色譜法對(duì)綠原酸、黃芩苷含量的測(cè)定結(jié)果 供試藥品、對(duì)照品溶液的制備及色譜條件：

桑葉藥材：精密稱取桑葉藥材100.7 mg，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱重，超聲提取30 min放冷后再稱重，補(bǔ)足損失溶劑量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，用0.45 um的微孔濾膜濾過(guò)備用，濃度為4.028 mg/mL。

綠原酸：取在105℃干燥至恒重的綠原酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL中含0.024 mg的溶液即得。

儀器：Agilent1200/007色譜儀；色譜柱：Waters SymmetryshieldTMRP18柱(4.6 mm*250 mm，5 um)；流動(dòng)相：甲醇-0.5%磷酸水溶液(18：82)；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：350 nm；進(jìn)樣量：10 uL。

用該法測(cè)定的綠原酸對(duì)照品、桑蟬樣品、陰性對(duì)照品的HPLC圖譜見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品

圖2 桑蟬樣品

圖3 缺桑葉空白樣品

木蝴蝶藥材：精密稱取木蝴蝶藥材219.4 mg,置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱重，超聲提取30 min放冷后再稱重，補(bǔ)足損失溶劑量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)備用，濃度為8.776 mg/mL。

黃芩苷：取在105℃干燥至恒重的綠原酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL中含0.11 mg的溶液即得。

儀器：Agilent1200/007系列色譜儀；色譜柱：Waters SymmetryshieldTMRP18柱(4.6 mm*250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-0.5%磷酸水溶液(B)梯度洗脫，[0-32 min,A (40-40);32-35 min,A (40:45);35-40(45-45)〗；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：316 nm；進(jìn)樣量：10 μl。

用該法測(cè)定的黃芩苷對(duì)照品、桑蟬樣品、陰性對(duì)照品的HPLC圖譜見(jiàn)圖4～圖6。

圖4 黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品

圖5 桑蟬樣品

圖6 缺木蝴蝶空白樣品

2.2 各指標(biāo)成分測(cè)定及計(jì)算結(jié)果 根據(jù)高效液相色譜法測(cè)定所得各指標(biāo)成分的峰面積值，計(jì)算L9(34)正交表項(xiàng)下各指標(biāo)成分的轉(zhuǎn)移率，轉(zhuǎn)移率的計(jì)算公式為：

轉(zhuǎn)移率= 相應(yīng)藥材提取含量*提取物量/藥材含量*藥材量

轉(zhuǎn)移率一般是50%以上。

結(jié)果見(jiàn)表2～表3。

表2 綠原酸轉(zhuǎn)移率計(jì)算結(jié)果

表3 黃芩苷轉(zhuǎn)移率計(jì)算結(jié)果

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 見(jiàn)表4～表5。

表4 醇提工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

綜合評(píng)分M=綠原酸轉(zhuǎn)移率/綠原酸轉(zhuǎn)移率最大值*30%+黃芩苷轉(zhuǎn)移率/黃芩苷轉(zhuǎn)移率最大值*15%+其他藥材65%。

表5 醇提工藝正交試驗(yàn)方差分析表

正交試驗(yàn)結(jié)論：以綜合評(píng)分為標(biāo)準(zhǔn)，直觀分析表明，在所選因素水平范圍內(nèi)，各因素作用順序?yàn)樘崛〈螖?shù)>提取時(shí)間>醇用量>醇濃度，最佳提取方案A2B3C3D3，而方差分析結(jié)果表明因素A(醇濃度)、因素B(醇用量)、因素C(提取次數(shù))因素D(提取時(shí)間)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均無(wú)顯著影響(P>0.05)。由于各因素的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)不具有顯著性，且醇提取后還要進(jìn)行水提，為降低成本，故將醇提工藝定為A2B2C2D2，即取藥材量8倍的70%乙醇回流提取2次，每次2 h。

2.4 醇提驗(yàn)證試驗(yàn) 為了進(jìn)一步考察優(yōu)選工藝的可靠性及穩(wěn)定性，取3份按處方量稱取的藥材，按醇提正交試驗(yàn)所得提取工藝即取藥材量8倍的70%乙醇回流提取2次，每次2 h進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 醇提驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

從表6可看出，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正交表中最優(yōu)實(shí)驗(yàn)組結(jié)果相當(dāng)，指標(biāo)成分的轉(zhuǎn)移率都在50%以上，說(shuō)明該優(yōu)選工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

桑蟬止咳方為多味藥組成的復(fù)方，眾所周知中藥復(fù)方成分眾多且復(fù)雜，為保證提取工藝的可控性，我們采用了高效液相色譜對(duì)多個(gè)有效指標(biāo)性成分含量測(cè)定的定量控制方法，該方法具有可控性好，準(zhǔn)確程度高的特點(diǎn)；而且多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)提取工藝較以往的單指標(biāo)評(píng)價(jià)方法更為全面，但是中藥復(fù)方的優(yōu)勢(shì)在于眾多成份協(xié)同作用，以達(dá)到多靶點(diǎn)多方位治療疾病的目的，因此否能有效治療疾病并非簡(jiǎn)單的將各指標(biāo)成分疊加，還應(yīng)結(jié)合藥理和和藥效等方面的試驗(yàn)，才能進(jìn)一步確定方劑的功效。

本醇提正交實(shí)驗(yàn)以綜合評(píng)分為標(biāo)準(zhǔn)，直觀分析結(jié)果表明，在所選因素水平范圍內(nèi)，各因素作用順序?yàn)椋禾崛〈螖?shù)C>提取時(shí)間B>醇用量A>醇濃度，最佳提取方案為最佳提取方案A2B3C3D3，而方差分析結(jié)果表明因素A(水用量)、B(提取時(shí)間)、C(次數(shù))對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均無(wú)顯著影響(P>0.05)。醇提取后還要進(jìn)行水提，為降低成本，故將醇提工藝定為A2B2C2D2，即取藥材量8倍的70%乙醇回流提取2次，每次2 h，經(jīng)醇提正交驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明該工藝是穩(wěn)定和可行的。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄Ⅵ D.