體外再生胰島移植治療糖尿病的研究近況

遲欣 周光紀

體外再生胰島移植治療糖尿病的研究近況

遲欣 周光紀

糖尿病是因胰島素抵抗和(或)胰島功能損害所致的以高血糖為特征的內分泌代謝性疾病。傳統治療方法以藥物治療為主。藥物治療能控制癥狀，但不能徹底治愈糖尿病。胰島移植是目前治療糖尿病的有效方法，但胰島供體的嚴重缺乏使其推廣應用受到了很大限制。由于干細胞具有自我復制能力和多向分化潛能，理論上可為胰島移植提供豐富的胰島細胞來源。近年來，對于胚胎干細胞、胰腺干細胞、間充質干細胞以及誘導性多功能干細胞等誘導分化為胰島樣干細胞的研究為糖尿病治愈帶來了新希望。

一、胰島移植現狀

過去的臨床實踐發現，胰腺移植是治療糖尿病的有效方法[1]。然而由于胰腺移植需要同時處理胰腺的內分泌和外分泌問題，手術方式復雜，并發癥多。更重要的是，胰腺移植組織配型困難，移植排斥嚴重。與傳統的胰腺移植或胰腺-腎臟聯合移植相比，胰島移植時沒有招致排斥反應的重要結構——血管，也沒有復雜的外分泌問題需要處理，而是可以采用注射等簡單方法移植于肝臟、皮下、腎包膜等合適部位，術式簡單，手術創傷小，移植排斥弱，并發癥少，因而更易于在臨床開展[2]。在早期的胰島移植臨床研究中發現，1型糖尿病患者胰島移植后短期不依靠外源性胰島素者達到了百分之十[3]。后來，加拿大埃德蒙頓市阿拉伯塔大學的一個研究小組通過認真的病例選擇和胰島分離、純化過程的優化，首次采用了不使用具有胰島毒性的類固醇激素的抗移植排斥的方法，使胰島移植患者術后不依賴胰島素的時間長達一年之久。這在胰島移植領域具有“里程碑”式意義，被譽為“埃德蒙頓方案”(Edmenton protocol)[4]。2008年美國聯合胰島移植注冊網站上發布的數據稱，1999至2007年間279位接受胰島移植的患者中有23%不依賴胰島素生存3年以上，5年的隨訪報告稱65位注冊的患者中有10%不依賴胰島素生存5年以上[5]。像其他器官移植一樣，胰島移植也存在嚴重的器官供體短缺，而且更為嚴重。即使是贏得一致贊譽的埃德蒙頓方案，也需要2～3個成年胰腺供體才能滿足一個成年患者的移植需要，這不僅使器官供體短缺問題更加突出，還使本來已不易解決的移植排斥問題更加復雜。因此，找到新的胰腺β細胞的來源成為人們研究的熱點。

二、干細胞再生胰島移植治療糖尿病

由于干細胞具有自我復制能力和多向分化潛能，理論上可以將其定向誘導分化，形成“人工胰島”，為胰島移植提供豐富的胰島細胞來源。其中以胚胎干細胞、胰腺干細胞和間充質干細胞的研究最引人關注。

1．胚胎干細胞定向分化誘導產生的“人工胰島”移植治療糖尿病：胚胎干細胞是來源于胚胎囊胚期“內細胞團”的一種未分化全能型細胞，具有強大的自我更新能力并能分化為機體所有類型的組織細胞。它強大的自我更新能力和全能分化特性使其成為胰島β細胞替代治療(β-cell replace therapy)的種子細胞來源。Sofia等[6]將人Ins基因通過載體轉入小鼠胚胎干細胞后誘導分化成能分泌胰島素的β-樣細胞。體外檢測這些細胞分泌胰島素的量可隨糖濃度的增加而增加。將這些來源于胚胎干細胞的β樣細胞植入1型糖尿病小鼠體內后，其血糖正常可達1年以上。但Lumelsky等[7]用5步法將小鼠胚胎干細胞誘導分化成的類似胰島結構細胞的胰島素分泌量僅相當于正常細胞分泌量的1/50，這些細胞移植到糖尿病小鼠并不能糾正高血糖。周光紀等[8]改良了Lumelsky的誘導方法，經過5階段約28～32 d的連續培養誘導，將小鼠的ESC細胞誘導成具有胰島素分泌功能的胰島樣β細胞，在培養液中加入磷酸肌醇激酶抑制劑，將胰島樣細胞分泌的胰島素含量提高到正常細胞分泌量的1/10并能輕度改善高血糖狀態。我們實驗室經過優化，使ESC分化為胰島素分泌細胞的時間從文獻報道的18～32 d縮短為18 d左右。將這些胰島素分泌細胞移植肝內6 d后血糖明顯下降，但未恢復到正常水平；而移植腹股溝區皮下6 d血糖降至正常[9]。劉星霞等[10]將胚胎干細胞誘導的胰島樣細胞團兩次皮下移植于DM小鼠，第5天血糖水平顯著降低，但仍未能降至正常水平。Lester等[11]利用熒光標記的方法證實，恒河猴胚胎干細胞可以分化成能夠分泌胰島素的細胞，為臨床模型奠定了基礎。Duvillie等[12]證實人胚胎干細胞體外在葡萄糖刺激下可以分化為胰腺β樣細胞，可以在培養基中分泌胰島素。Kroon等[13]利用人胚胎干細胞誘導得到胰腺內胚層，移植入小鼠體內后能夠根據血糖的波動相應地產生適量的胰島素，移植入小鼠體內產生胰島素的細胞表現出許多像β細胞轉錄因子等功能性β細胞的特征性標記物。

雖然誘導胚胎干細胞向胰島定向分化的潛能得到證實，但由于對胚胎干細胞向胰島β細胞分化的關鍵過程缺乏了解，所以至今沒有一種真正權威的誘導方法。轉化效率低、胰島素分泌功能差是目前存在的主要問題。

D′Amour等[14]通過調整培養基中生長因子和小分子抑制劑的成分，從hES細胞系(CyT203)獲得有胰島素分泌功能的細胞，在誘導分化5個階段中PDX-1、NGN3、INS以及GCG的表達水平和人體胰腺發育過程中對應階段相同。并應用蛋白質印跡法和免疫熒光技術證實，由hES分化來的細胞胰島素分泌水平與人體胰島的水平相當。Assady等[15]將用改良的四步法誘導hES得到的胰腺細胞移植到裸鼠皮下，移植兩個月后血清中C肽含量快速升高，3個月時血清C肽蛋白含量與小鼠移植3000～5000個人胰島的分泌量相當。經免疫組化證實，由hES分化來的細胞具有完整的β細胞特性。將這些細胞移植到用STZ破壞了胰島的小鼠，并沒有因為內源性胰島的破壞而影響對血糖的調節，說明hES分化來的內分泌細胞在調節血糖的過程中起到了關鍵作用。

2．胰腺干細胞誘導分化形成“再生胰島”治療糖尿病：胰腺干細胞主要存在于胰島中，也有少量存在于胰腺導管上皮細胞中。從胰腺干細胞產生“再生胰島”一般有體外擴增誘導和體內誘導兩種方法[16]。Vaca等[17]從人胰腺導管上皮細胞中分離到胰腺干細胞，經體外培養后得到有胰島樣結構的細胞團，但其擴增的周期長,所得細胞數量少。我們課題組王燕虹用正交設計優化了培養基成分和人胚胎胰腺干細胞的分離純化方法，從妊娠4～6個月流產的胎兒胰腺組織中分離胰島，然后將胰島貼壁培養，擴增胰島中的胰腺干細胞。結果發現，擴增15代后,細胞總數可達原來的1010倍；具有胰腺干細胞標志的ABCG2陽性細胞和nestin陽性細胞可達原來的1012倍，且ABCG2陽性細胞的擴增能力要優于nestin陽性細胞。這些經連續擴增的細胞經過體外定向誘導可形成具有胰島素分泌功能的細胞，自發聚集成具有胰島樣結構的胰島樣細胞團(islet-like cell clusters,ICCs),并對葡萄糖刺激敏感[18]。Ramiya等[19]從未發病的成年非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的胰導管上皮中分離出胰腺干細胞，經體外擴增并誘導分化為胰島樣細胞團，移植后兩周內血糖有所下降，但血糖濃度仍高于正常水平。Huang[20]、Wu等[21]的研究也將人胎兒胰腺組織來源的胰腺干細胞誘導分化為胰腺內分泌細胞，移植入糖尿病小鼠體內可糾正其高血糖。趙婷等[22]發現，移植胰腺干細胞后的大鼠在移植后第6周血糖開始降低并且能夠長時間使血糖維持在較低的水平，但對葡萄糖的刺激沒有快速相的胰島素分泌。張悅、楚元奎等[23-24]分別從胎鼠及胎豬中分離得到胰腺干細胞，經體外擴增后移植入相應糖尿病模型，發現胰島樣干細胞在體內微環境的調節下增殖為胰島樣結構，并且受體的血糖水平得到了較好控制。

3．間充質干細胞再生胰島移植治療糖尿病：文獻報道，骨髓、臍帶血來源的間充質干細胞，通過對pdx-1基因的誘導，也會具有胰島β樣細胞的特征，并且具有取材方便，體外誘導、分離、培養和純化簡單的特點[25]。余衛等[26]從胎鼠肝臟中分離出間充質干細胞誘導分化為胰島樣β細胞，移植到1型糖尿病小鼠的腎被膜下，6周后小鼠的血糖得到良好的控制。臍帶、骨髓來源的干細胞也成功被誘導分化為胰島β樣細胞，在大鼠的糖尿病模型中得到應用并取得良好效果。龐榮清等[27]將骨髓來源的β樣細胞移植于彌猴，證實可以使血糖、胰島素和c肽的分泌回復正常。

4．誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cell,iPS)在糖尿病治療中的前景：隨著新技術的應用，人的成體細胞能夠被重新誘導成象胚胎干細胞一樣的多能干細胞——誘導性多能干細胞[28]。誘導性多能干細胞的成功獲得使得胰島β細胞的來源有了新的前景。2009年，Maehr等[29]用1型糖尿病患者的成纖維細胞誘導出iPS細胞分化出了具有胰島素分泌功能的細胞，為糖尿病的治療開辟了新的途徑。iPS的出現使可以自體移植、完全不出現移植排斥的“自體胚胎干細胞”成為現實，是近年來最令人鼓舞的進展。

三、問題與展望

干細胞體外定向誘導成胰島素分泌細胞移植，為糖尿病的治療帶來了新的希望，但仍有諸多問題需要解決。(1)轉化效率問題：目前從干細胞分化為胰島素分泌細胞的轉化效率較低，大量干細胞誘導后僅能得到數量有限的胰島素分泌細胞，且其功能較差，遠遠不能滿足臨床實際運用的要求。(2)分化細胞的“年齡結構”問題：干細胞在體外擴增后同步誘導分化，所有細胞均同步分化為成熟細胞。這些細胞移植后，同步地生長、衰老，最后也同步消亡，使療效完全喪失。這顯然不符合治療的要求。如何能使移植細胞具有“年齡結構”，做到“可持續發展”，長期保持療效，是今后要解決的重要問題。(3)移植排斥問題：異體來源的干細胞形成的胰島素分泌細胞是否具有免疫原性，過去未受到足夠重視。我們最近剛完成的實驗發現(資料待發表)，在胚胎干細胞向胰島素分泌細胞分化過程中，引起移植排斥的主要組織相容性抗原(MHC)表達進行性增加，激活淋巴細胞的能力也相應地增強，移植后出現強烈的移植排斥反應。這說明和傳統的組織器官移植一樣，胚胎干細胞衍生的組織、器官移植也一樣面臨排斥問題。間充質干細胞和誘導性多能干細胞有可能實現“自體移植”，避免移植排斥，但其他問題依然存在。

[1] Reaney JS, Woodcock AJ, Smith RM, et al.Patient-reported outcomes following islet cell or pancreas transplantation (alone or after kidney) in Type 1 diabetes: a systematic review.Diabetic Medicine,2010,27:812-822.

[2] Ludwig B, Ludwing S, Steffen, A et al. Islet Versus Pancreas Transplantation in Type 1 Diabetes: Competitive or Complementary？Curr Diab Rep,2010,10:506-511.

[3] Scharp DW, Lacy PE, Santiago JV, et al. Results of our first nine intraportal islet allografts in type 1, insulin-dependent diabetic patients. Transplantation, 1991,51:76-85.

[4] Shapiro AM, Lakey JR, Ryan EA, et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med, 2000,343:230-238.

[5] Ryan EA, Paty BW, Senior PA, et al.Five-year follow-up after clinical islet transplantation. Diabetes,2005,54:2060-2069.

[6] Sofia B，Roche E，Berna C，et al. Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotcein-induced diabetic mice．Diabetes，2000,49:157-162．

[7] Lumelsky N，Blondel O，Laeng P，et al．Differentialion of embryonic stem celIs to insulin-secreting structures similar to pancreatic islets．science，2001,292:1389-1394．

[8] 周光紀,屈紀富,徐海偉,等.無血清培養法誘導小鼠胚胎干細胞分化為胰島素分泌細胞的實驗條件優化選擇.中國臨床康復, 2005, 9:23-26.

[9] Hori Y,Rulifson IC,Tsai BC,et al.Growth inhibitors promote differentiation of insulin-producing tissue from embryonic stem cells.Proc Natl Acad sci USA, 2002,99:16105-16110．

[10] 劉星霞，繆兵，李府，等.胚胎干細胞ES-D3誘導分化胰島素分泌細胞及其對糖尿病鼠降糖作用的研究.世界華人消化雜志，2004，12:1853-1856.

[11] Lester LB, Kuo HC, Andrews L, et al. Directed differentiation of rhesus monkey ES cells into pancreatic cell phenotypes. Reprod Biol Endocrin, 2004,2:42-45.

[12] Duvillie B,Heinis M ,Stetsyuk V. In vivo and vitro technique to study pancreas development and islet cell function．Endocr Dev,2007,12：46-54．

[13] Kroon E, Martinson LA, Kadoya K, et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo.Nat Biotechnol,2008,26:443-452.

[14] D′Amour KA, Bang AG, Eliazer S,et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol, 2006,24:1392-1401.

[15] Assady S, Maor G, Amit M, et al. Insulin production by human embryonic stem cells. Diabetes, 2001,50:1691-1697.

[16] Segev H, Fishman B, Ziskind A, et al. Differentiation of human embryonic stem cells into insulin-producing clusters. Stem Cells, 2004,22:265-274.

[17] Vaca P,Berná G,Araujo R,et al. Nicotinamide induces differentiation of embryonic stem cells into insulin-screting cells.Exp Cell Res, 2008, 314:969-974.

[18] 王燕虹.人胰腺干細胞的體外擴增及其向胰島素分泌細胞分化誘導的實驗研究.[學位論文],湛江:廣東醫學院,2009，34-44.

[19] Ramiya VK, Michael M, Arfors K E,et al. Reversal of insulin-dependent diabetes using islets generated in vitro from pancreatic stem cells, Nat Med,2000,6,278-282.

[20] Huang H, Tang X.Phenotypic determination and characterization of nestin-positive precursors derived from human fetal pancreas. Lab Invest,2003,83:539-547.

[21] Wu F, Jagir M, Powell JS. Long-term correction of hyperglycemia in diabetic mice after implantation of cultured human cells derived from fetal pancreas. Pancreas,2004,29: e23-e29.

[22] 趙婷，喬海，賈文文，等.人胰腺干細胞誘導胰島樣細胞團及治療大鼠糖尿病的效果.中國組織工程研究與臨床康復，2007，11:1259-1262.

[23] 張悅，張育森，余小舫，等.胎鼠胰腺干細胞原位移植治療糖尿病的實驗研究.中國病理生理雜志，2008，24：1595-1599.

[24] 楚元奎，曹暉，王赟，等.胎豬胰腺干細胞體外誘導分化為胰島素分泌細胞及其移植治療裸鼠糖尿病的研究.農業生物技術學報，2011，19：9-17.

[25] Chao KC,Chao KF,Fu YS,et al.Islet-like clusters derived from mesemchymal stem cells in whartons jelly of the human umbilical cord for transplantation to control type 1 diabetes. PLoS One,2008,3:ele51.

[26] 余衛，何冬梅，張洹. 胎肝間充質干細胞治療實驗性糖尿病小鼠的研究.暨南大學學報(自然科學與醫學版)，2007，28：558-561.

[27] 龐榮清,張成,項鵬,等.骨髓間充質干細胞誘導為胰島樣細胞后自體移植治療糖尿病獼猴.中華內分泌雜志，2008，1：70-73.

[28] Park IH, Zhao R, West JA, et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature,2007，451: 141-146.

[29] Maehr R, Chen S, Snitow M,et al. Generation of pluripotent stem cells from patients with type 1 diabetes. Proc Natl Acad Sci USA，2009，106:15768-15773.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.027

國家自然科學基金(30772769)，廣東省科技計劃項目(63044)

524023 廣東湛江，廣東醫學院生理學教研室

周光紀，Email:gdmczhou@126.com

2011-10-13)

(本文編輯：呂芳萍)