FTY720通過激活CaMKK/Akt通路減輕全腦缺血再灌注損傷

許 靜， 劉志安， 高殿帥

臨床及流行病學研究已表明，腦卒中的病因絕大多數是動脈粥樣硬化引起，高密度脂蛋白-膽固醇具有抗動脈硬化的作用。臨床資料表明高密度脂蛋白在缺血性腦卒中患者明顯降低，其保護因素降低可能是卒中發生的原因之一［1，2］。從病因學角度研究高密度脂蛋白受體在治療腦卒中方面具有重要的臨床指導意義。

S1P受體是眾多高密度脂蛋白受體的一種，其激活后可以產生廣泛的生物學效應，如抑制細胞凋亡、增加細胞內鈣離子濃度、調節粘附分子表達等。S1P受體激活的抗凋亡作用在心肌、腎臟等組織缺血中研究較多［3，4］，在腦缺血中的作用則少有報道，其機制更不甚清楚。本研究的目的是探討S1P受體激動劑FTY720對全腦缺血復灌的神經保護作用，以及其是否通過激活CaMKK/Akt信號通路而發揮保護作用，為腦缺血的臨床治療提供新的策略和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD大鼠，250～280g，清潔級，由徐州醫學院實驗動物中心提供。實驗動物隨機分為5組(每組n=8):假手術組(sham組)、缺血/再灌注1d組(I/R組)、I/R+FTY720給藥組(F組)、I/R+STO-609給藥組(S組)及I/R+溶劑DMSO對照組(D組)。

1.1.2 試劑 p-Akt(S473)及 Akt兔多克隆抗體 (Cell Signal公司);抗CaMKK多克隆抗體、羊抗兔單克隆抗體 (Santa Cruz公司);FTY720(Cayman公司);STO-609(Sigma公司);NBT/BCIP(Promega公司提供);BCA蛋白定量試劑(碧云天生物技術研究所);TUNEL試劑盒(北京中杉金橋生物公司)，其它常用試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 動物以20% 水合氯醛(300～350mg/kg)腹腔注射麻醉后制作四動脈結扎全腦缺血模型。全腦缺血15min、再灌注1d后行凋亡和免疫印記檢測。缺血前大鼠處于清醒狀態，其生命體征完全正常。缺血時保持其直腸溫度在36.5℃ ～37.5℃之間。缺血后30～60s內以翻正反射消失、四肢僵直、同時痛覺消失、雙側瞳孔散大等體征表現判斷缺血模型的可靠性。假手術組處理同實驗組，但不結扎雙側頸總動脈。

1.2.2 給藥 FTY720以0.5mg/ml的濃度溶于1%DMSO，于缺血前30min以1mg/kg腹腔注射;STO-609以1μg/μl的濃度溶解于1%DMSO，利用微量注射器通過側腦室于FTY720給藥后20min注射(從前囟后開0.8毫米、旁開1.5毫米、深3.5毫米)，每只大鼠給藥10μl，10min內注完。注射同體積的DMSO作為陰性對照。

1.2.3 蛋白樣品制備 大鼠缺血15min再灌注1d后，快速斷頭取海馬，分區，取CA1區置液氮中凍存備用。使用時從液氮中取出海馬加冰冷的勻漿緩沖液勻漿，高速勻漿(10s×6次)，4℃下1000g離心15min去除沉淀物收集上清樣品。

1.2.4 蛋白含量測定 采用BCA蛋白定量試劑盒，按說明書操作。

1.2.5 凋亡檢測(TUNEL染色) 各組動物以4℃預冷生理鹽水、40g/L多聚甲醛行心臟灌注，斷頭取腦，在視交叉前后1.5mm處冠狀切片取材，常規固定、脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片，采用Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection試劑盒，按說明書操作行TUNEL染色。

1.2.6 免疫印跡(IB) 等量蛋白樣品經10%SDS-聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，以濕轉或半干轉法電轉移至NC膜上。轉移后的NC膜經3%BSA封閉后加入不同的稀釋后的一抗，4℃過夜。用洗滌液洗膜，加入相應的二抗，室溫反應2h。洗膜后以NBT/BCIP顯色，結果以Image圖像分析軟件處理。

1.2.7 數據處理 數據以均數±標準差表示，統計分析采用方差分析(ANOVA)，多個實驗組與一個對照組比較用最小顯著差法(LSD)，實驗組之間比較采用 q檢驗(Newman-keuls test)，P ＜0.05為統計學有差異。

2 結果

2.1 各組海馬CA1區神經元的凋亡 缺血復灌1d后的凋亡細胞顯示不規則形，褐色深染(見圖1)。假手術組未見凋亡細胞，缺血復灌1d后引起嚴重細胞凋亡，TUNEL陽性細胞數為118.8±12.4;給予FTY720后陽性細胞數為55.9±8.1，較I/R組凋亡細胞明顯減少(P＜0.05)，保護作用達到50.4%左右;STO-609組凋亡細胞數(90.7±10.5)較FTY720組明顯增多(P＜0.05)。

2.2 各組CaMKK表達水平、Akt磷酸化水平給予FTY720后(見表1、圖2)，CaMKK免疫印記灰度值為 2.247 ±0.239，p-Akt灰度值為 2.405 ±0.265，較 I/R 組明顯升高(P ＜0.05);而 STO-609組 CaMKK 灰度值為1.294 ±0.130，p-Akt灰度值為1.153 ±0.144，較 FTY720 組明顯降低(P ＜0.05);各組Akt表達水平無明顯變化，溶劑對照組CaMKK表達和Akt磷酸化水平亦無明顯變化。

3 討論

S1P受體有5種類型即S1P1～S1P5，其表達具有一定組織特異性。在哺乳動物的大腦中表達的主要是S1P1～S1P3受體，激動劑為FTY720，其抗凋亡作用在心肌缺血中研究較多，在腦缺血損傷中的作用不甚清楚。有研究發現，局灶缺血再灌注后大鼠梗死灶周圍區皮質S1P1的蛋白表達水平明顯升高，再灌注后3h、12h 達到高峰，24h 開始下降［5］;在細胞水平上，FTY720可以減少谷氨酸導致的小鼠大腦皮質細胞凋亡［6］;最新研究表明FTY720激活S1P受體顯著縮小局灶腦缺血梗死體積，改善神經功能評分，減少了凋亡細胞數量［7］。以上研究結果提示FTY720激活S1P受體后在腦缺血中發揮重要抗凋亡作用。本研究發現給予FTY720可以顯著降低I/R導致的凋亡細胞數，進一步證實了FTY720在腦缺血中的神經保護作用，但是具體的信號轉導機制國內外少有報道。

S1P受體屬于G蛋白偶聯受體，S1P受體與Gq偶聯［8］引起胞內鈣庫 Ca2+釋放。有研究表明 S1P與其受體結合后，胞內Ca2+釋放激活了Ca2+/CaM依賴的蛋白激酶的激酶 CaMKK從而Akt激活，減輕了內皮細胞的功能障礙［9］，這說明S1P受體介導的內源性Ca2+釋放可能起著抗凋亡的作用。長期以來，在Akt信號通路的研究中，一般認為Akt的激活是由PI-3K直接介導的，研究的重點主要集中在PI-3K及其上游激酶上。有研究報道胞內Ca2+濃度下降或是鈣調蛋白CaM功能缺失會嚴重影響一些生長因子介導的Akt活化和神經元的存活［10］;在細胞水平上CaMKK可以直接激活Akt［11，12］，使其T308和S473位磷酸化，促進細胞的存活;另有報道腦源性神經營養因子激活大鼠海馬原代神經元上表達的 CaMKK，進而激活 Akt［13］。這些研究表明CaMKK在Akt激活過程中發揮重要的調節作用。Yano等［14］將CaMKK和Akt共轉染于COS7細胞中發現Akt被磷酸化而激活，隨后在豚鼠預缺血模型中發現Akt磷酸化水平較缺血組升高，CaMKK作為Akt的上游激酶發揮拮抗缺血性損傷的作用。

本研究還發現FTY720顯著提高大鼠I/R過程中海馬神經元CaMKK的表達和Akt的磷酸化水平，而CaMKK的抑制劑STO-609則逆轉了這種作用;TUNEI檢測結果也表明給予STO-609后凋亡細胞數較FTY720組明顯增多，說明FTY720可能通過激活CaMKK/Akt信號通路發揮其在腦缺血損傷中的抗凋亡作用。

綜上所述，S1P受體激動劑FTY720能夠提高全腦缺血再灌過程中CaMKK表達水平，進而激活Akt發揮神經保護作用，CaMKK/Akt信號通路可能成為治療腦缺血的有效靶點，而S1P受體激活后如何啟動CaMKK/Akt信號通路，其機制還有待進一步的研究。

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