重組雙基因表達質粒pIRES-NGF-VEGF165轉染大鼠BMSCs及表達鑒定

范波勝， 婁季宇， 白宏英

腦梗死缺血壞死區血循環的改善和受損神經組織的修復與功能重建，一直是腦梗死治療的兩個重點，只有這兩者的有效解決才有可能提高腦梗死的治療效果。神經生長因子(nerve growth factor，NGF)是重要的神經營養因子之一，能夠促進和維持神經細胞生長、存活，對腦缺血有重要的神經保護作用［1］。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是具有高度特異性的促血管內皮生長的細胞因子，能夠促進血管新生、改善缺血壞死區的血液循環，是治療腦梗死極有前途的細胞因子之一［2］。因此，將兩者聯合應用于腦梗死的治療有望取得較好的治療效果。本研究擬采集和培養大鼠骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)，并將其作為靶細胞，借助脂質體轉染技術將已構建成功的重組pIRES-NGF-VEGF165雙基因真核表達質粒導入大鼠BMSCs，以求獲得NGF和VEGF的有效表達，為下一步使用NGF和VEGF雙基因修飾的BMSCs移植治療腦梗死大鼠打下重要基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 健康1月齡SD大鼠，雌雄不限，體重約120g，用于骨髓搜集，由鄭州大學實驗動物中心提供;PC12細胞為新鄉醫學院分子醫學實驗室王天云博士惠贈;種蛋由新鄉市平原雞場提供。pIRES質粒購自 Clontech公司，重組 pIRES-NGFVEGF165質粒由本研究室構建。Percoll細胞分離液購自Sigma公司，脂質體LipofectamineTM-2000購自Invitrogen公司，總RNA提取試劑盒、RT-PCR擴增試劑盒購自 QIAGEN公司，兔抗大鼠 NGF、VEGF165多克隆抗體和SP9001試劑盒均購自Santa Cruz公司。

1.2 大鼠 BMSCs的采集與體外培養［3］將SD大鼠斷頭處死，無菌條件下取出股骨和脛骨，LDMEM培養液沖洗骨髓腔，收集沖洗液，緩慢加入等體積的Percoll細胞分離液，離心后小心吸取白膜細胞層，PBS洗滌后離心，去上清，加入L-DMEM培養基(含20%FBS，pH7.4)制成細胞懸液，調節細胞密度大于5×106/ml，接種于 50ml培養瓶，置于37℃、5%CO2以及飽和濕度的培養箱內培養。每3d換液一次，待細胞長至80% ～90%時，1∶2消化傳代，重復傳代，即可得到純化的BMSCs。

1.3 基因轉染 待培養至第3代的大鼠BMSCs細胞長至80% ～90%融合時即可進行轉染，分為3組。A組:正常培養的BMSCs;B組:pIRES空質粒轉染 BMSCs組;C組:重組 pIRES-NGFVEGF165質粒轉染BMSCs組。轉染過程按脂質體LipofectamineTM-2000轉染試劑操作說明進行。轉染后在各組細胞培養液內按400μg/ml加入G418進行篩選，每3d換一次培養液，約1w左右A組細胞全部死亡，其余兩組出現抗性細胞克隆，挑選單克隆細胞，將G418濃度降至200μg/ml維持，繼續擴增培養后收獲細胞和上清液進行下列檢測。

1.4 RT-PCR 檢測 NGF、VEGFl65 mRNA 的表達 分別根據GENEBANK數據庫提供的NGF和VEGF165基因序列，設計NGF的擴增引物為:P1:5’-GCC ATG TCC ATG TTG TTC TAC ACT C3’，P2:5’-GCC TCA GGC TCT TCT CAC AGC CTT C3’;VEGF165的擴增引物為:P3:5’-GGC ATG AAC TTT CTG CTG TCT-3’，P4:5’-GCG TCA CCG CCT CGG CTT GTC-3’。分別提取3組細胞總的RNA，合成cDNA，建立各自的PCR反應體系。NGF的PCR反應條件為:95℃預變性3min，94℃變性40s，60℃退火30s，72℃ 延伸 40s，30個循環后于 72℃ 延伸3min;VEGF的PCR反應條件為:94℃預變性5min，94℃變性 60s，56℃退火 45s，72℃延伸 45s，30 個循環后于72℃延伸3min;反應后取PCR產物進行電泳分析。

1.5 Western blot法檢測 NGF、VEGFl65 蛋白的表達 收集各組細胞培養72h的上清液，濃縮后進行SDS-PAGE電泳、轉膜和封閉，按1∶200加入一抗(兔抗大鼠 NGF或 VEGF165多克隆抗體)，TBST洗滌后加入1∶1000稀釋的HRP標記的二抗，TBST洗滌后在暗室中加ECL檢測試劑，X線曝光、顯影和定影保存。使用β-actin抗體作為上樣對照。

1.6 NGF、VEGFl65 蛋白的活性檢測 (1)利用PC12細胞生長試驗進行NGF蛋白的活性檢測［4］:將PC12細胞用不含小牛血清的DMEM完全培養基接種于24孔板內，收集各組用無血清培養基培養72h的上清液滴加至各孔內，0.5ml/孔。置于37℃、5%CO2以及飽和濕度的培養箱內培養72h，觀察PC12細胞生長形態變化。(2)利用雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管新生實驗進行VEGF的活性檢測［5］:將種蛋氣室向上放入溫箱(37.8℃)，第 8 天時借助照蛋器標記胎位，在絨毛尿囊膜體表投影距胎頭1cm處將蛋殼鋸開一小三角形孔，虹膜刀切破殼膜，暴露出CAM，將濾紙片貼在CAM上，使用加樣器將各組培養72h的上清液100μl加入濾紙上，透明膠帶封閉窗口，每日加樣一次，第12天時觀察CAM新生血管情況。

2 結果

2.1 大鼠BMSCs的分離、培養及形態特征應用密度梯度離心法獲得骨髓單個核細胞，多數懸浮于培養液中，其中以造血細胞占多數，通過數次換液后可清除這些細胞，可見少數細胞貼壁生長，呈圓形，逐漸分裂增殖，形成多個細胞團。第5～10天細胞團迅速生長，向周圍不斷擴大，相互融合，第10～14天后達到80% ～90%融合;1∶2傳代的細胞在1d內即可完全貼壁，不再以細胞團方式生長，呈均勻分布生長的梭形細胞。

2.2 轉染大鼠BMSCs及G418篩選 3組細胞加入400μg/ml G418后均出現絕大部分細胞死亡，從瓶底脫落，1w后正常對照組的細胞全部死亡，其它兩組細胞僅存留幾個細胞貼壁存活，將G418濃度降至200μg/ml維持篩選，約10d后出現抗性細胞克隆，挑取單克隆，置24孔板內繼續擴增培養。

2.3 RT-PCR 檢測 NGF、VEG165 mRNA 的表達 結果顯示:C組能夠擴增出726bp和576bp兩條目標條帶;而A組和B組未能擴出目標條帶。表明重組pIRES-NGF-VEGF165質粒轉染的BMSCs內有NGF和VEGF165 mRNA的表達。

2.4 Western blot法檢測 NGF、VEGF165 蛋白的表達 結果顯示:C組在13.2KD和26KD出現兩條目標條帶，提示有NGF和VEGF165重組蛋白的表達;而A、B組則未見目的蛋白表達。

2.5 轉染細胞NGF、VEGFl65蛋白的活性檢測

(1)PC12細胞生長試驗結果顯示:C組細胞培養上清液能夠促進PC12細胞發出如神經細胞樣突起;而A、B組細胞培養上清液不能促進PC12細胞發出突起，表明轉染NGF基因的BMSCs細胞分泌的NGF蛋白具有促進PC12細胞生長的生物學活性。(2)CAM血管新生實驗結果顯示:C組細胞培養上清液較A、B組細胞培養上清液能夠明顯促進CAM血管密度增加，血管增粗，分枝增多，表明轉染VEGF165基因的BMSCs表達的重組VEGF165蛋白具有促進CAM血管生長的生物學活性。

3 討論

目前，腦梗死的“三高”(即高發病率、高致殘率、高致死率)嚴重威脅著人類健康，盡管近年來腦梗死的治療已取得了很大進展，但治療效果仍不能令人滿意，人們一直在探索新的更有效的方法。隨著細胞工程和基因工程技術的不斷發展，基因治療已成為腦血管疾病防治的重要研究方向之一，尤其是將多種神經營養因子基因聯合應用于腦梗死的基因治療更是成為最近研究中的熱點。

目的基因、基因載體以及靶細胞的選擇是進行基因治療的重要基礎，直接關系到基因治療的成敗。本研究選擇NGF和VEGF165基因作為目的基因、真核雙基因表達質粒pIRES作為基因載體和大鼠BMSCs作為靶細胞來進行腦梗死的基因治療研究。首先，鑒于腦梗死治療的原則是既要盡快改善缺血壞死區血液循環又要促進受損神經組織的修復與功能重建，由于NGF對腦缺血有重要的神經保護作用，VEGF則具有促進血管新生、改善缺血壞死區的血液循環的作用，其中VEGF165是VEGF家族中發揮生物學功能的主要成分［2］，因此，我們選擇兩者作為目的基因。第二，選擇真核雙基因表達載體pIRES作為基因載體是由于該質粒不但具有一般真核表達載體的特點，更為突出的特點是在兩個多克隆插入位點之間設計有微小RNA病毒的內部核糖體進入位點(internal ribosomal entry site，IRES)。IRES可保證插入的兩個非相關基因能夠同時獨立高效地表達，所翻譯出的目的蛋白各自具有獨立的空間結構和生物活性，這一功能已經有大量實驗的證實［6，7］。第三，BMSCs是繼胚胎干細胞和神經干細胞之后，又一種在體內外均能向神經細胞分化的干細胞，它具有下列特點［8，9］:(1)易獲得性，骨髓穿刺就能得到該細胞，無倫理道德問題;(2)體外培養增殖速度快;(3)可通過血腦屏障到達腦內各部位，并長期存活;(4)免疫耐受;(5)還有可以被凍存和培養等特點，并且相關實驗［10］也證實附壁生長的骨髓間充質干細胞易通過基因轉染技術導入外源性基因，并可以在體內長期高效表達，因此BMSCs成為對神經系統疾病進行基因治療的理想靶細胞。

在本研究中，我們借助脂質體轉染技術將已構建成功的重組pIRES-NGF-VEGF165雙基因真核表達質粒導入BMSCs，經G418篩選，挑選陽性細胞克隆擴增培養。分別從基因和蛋白質水平進行檢測，即通過 RT-PCR方法檢測到轉染細胞中 NGF、VEGF165基因mRNA的表達，使用Western blot方法檢測到轉染細胞表達NGF、VEGF165蛋白。更進一步進行了兩者的活性檢測:首先利用PC12細胞進行NGF蛋白的活性檢測，PC12細胞來自于腎上腺嗜鉻細胞瘤，在有NGF的情況下，PC12細胞可發出突起形成類似神經細胞的表型［4］，我們通過收集轉染細胞培養72h的上清液，滴加于PC12細胞培養液中，結果見PC12細胞發出如神經細胞樣突起，證實所轉染細胞分泌的NGF蛋白具有生物學活性。接著利用CAM血管新生實驗進行VEGF165的活性檢測:CAM是雞胚外的一層膜，在雞胚發育過程中有大量尿囊膜血管的形成，為研究血管發生和形成提供了很好的模型，已經被廣泛地應用在促進血管生成和抗血管生成的研究之中［5］。我們通過收集轉染細胞培養72h的上清液，滴加于CAM上，可見CAM血管增粗，分枝增多，證實所轉染細胞分泌的VEGF165蛋白具有生物學活性。通過上述檢測證實，我們成功獲得了能夠有效表達NGF和VEGF165的大鼠BMSCs，為在下一步研究中將其移植治療腦梗死大鼠，發揮基因治療和干細胞治療-雙重治療效應奠定了實驗基礎。

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