實驗動物肝組織石蠟切片制作中易發問題探討

柏美玲 宋昱 林群凡 鄧爽 胡少青 伍義行

石蠟切片是組織病理學制片技術中最為常用的方法，廣泛應用于臨床診斷和科研教學中。石蠟切片制作涉及取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色、封片等系列步驟，影響因素眾多，且不同組織類型具有不同的特點，每個操作環節的失誤都將影響切片的最終質量［1］。肝組織具有細胞成分較多、細胞間隙較大、纖維結締組織較少、質地較脆等特點，肝組織蠟塊在切片時易碎裂，染色后常呈脫水和透明過度的表現(如出現大量裂紋等)，從而影響肝組織原始形態結構的觀察和結果的判斷。而實驗動物肝組織石蠟切片在肝病研究、抗肝炎藥物藥效評價、新藥毒理學評價和組織病理教學中起到了十分重要的作用。因此，本文結合自己的研究經驗，重點對常見實驗動物(大、小鼠)肝組織石蠟切片制作的特點和常見問題進行了分析總結，并提出了相應的解決方法。

1 取材

取材組織面積一般為1.5 cm×1.5 cm，厚度不超過0.3 cm，組織太大或過厚時均可降低脫水效果。取大小鼠肝組織時，應先進行放血處理，再解剖取肝組織，以防止肝組織內積血，影響切片效果。因肝組織屬于脆弱器官，應小心使用鑷子的彎月面移動或夾取器官，防止鑷子尖端損傷肝組織造成人為破壞。

2 固定

固定的目的在于保存組織內細胞原有的結構和形態。石蠟切片常用固定液有甲醛、乙醇、醋酸、AF液(乙醇+甲醛液)、AAF液(醋酸+乙醇+甲醛液)等，需根據實驗材料的性質及制片目的不同，選用適宜的固定液［2］。肝組織切片制作常選擇福爾馬林作為固定液，因其對肝組織具有較強的穿透力，可有效抑制溶酶體酶對肝組織的自溶和細菌的繁殖，保護正常的形態結構。切取標本后應盡快將標本置于盛有足夠固定液的容器內固定，以確保細胞形態上的原始性，防止組織死后自溶而產生變化［3］。固定液應以新配為好，選用福爾馬林固定肝組織時間應不少于4 h，不大于48 h。此外，也可采用微波處理法固定組織［4］。

3 脫水

脫水的目的是采用脫水劑將組織內的水份置換出來，以利于有機溶劑的滲入。常用脫水劑是酒精，而正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧六環等也可做脫水劑。動物肝組織常選用乙醇作為脫水劑，其優點是比較溫和，對組織傷害比較小。肝組織也可選用正丁醇脫水，其優點是可省去二甲苯透明直接浸蠟而縮短制作時間，且不會引起組織塊過度收縮，但易出現脫水不足的現象［5］。另外將正丁醇與乙醇按比例混合后作脫水劑效果也較好。脫水劑使用一段時間后，試劑揮發或者混雜其它雜質會引起濃度降低，均影響組織脫水效果［6］。因此，脫水劑要定期更換，更換時最好用比重計測量各級酒精的濃度［7］。此外，還應注意:①脫水應逐步進行，順序顛倒會極大影響脫水效果;②在無水乙醇中不得放置時間過長，否則會引起組織塊過度硬化，導致切片時組織破碎;③更換脫水劑時，浸泡時間需減去吸水過程中所耽誤的時間，以免脫水不足;④脫水必須在有蓋的玻璃瓶中進行，防止吸收空氣中的水分和酒精揮發，保證脫水徹底。

4 透明

透明劑可替換出組織內的乙醇，使石蠟順利地滲入組織中，增強組織的折光系數從而出現透明狀態。常用的透明劑有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇、香柏油等。動物肝組織常選用二甲苯作透明劑，因二甲苯對神經的麻醉作用及粘膜的刺激性，使用時應盡量在通風櫥內進行，也可用硬脂酸石蠟混合液代替二甲苯透明［8］。由于二甲苯對組織的收縮性強，作用迅速，故組織在二甲苯中時間不宜過長，否則組織容易變脆變硬。透明劑的浸漬時間要根據組織材料塊大小及性質而定。如果透明時間過短，則透明不徹底，石蠟難于浸入組織;透明時間過長，則組織硬化變脆，不易切出完整切片。動物肝組織若選用二甲苯為透明劑，可分為三階段(二甲苯Ⅰ20 min，二甲苯Ⅱ10 min，二甲苯Ⅲ10 min)進行。二甲苯應定期更換，以免揮發或吸濕造成濃度改變，影響透明的程度。此外，如果透明時組織周圍出現白色霧狀，說明材料中的水份未被脫凈，應退回重新脫水后再透明。

5 包埋

包埋是標本經脫水后浸入包埋劑，并使之滲透進入標本本體的過程。石蠟是常用的包埋劑，包埋用石蠟應與浸蠟用石蠟熔點一致，并且與樣品硬度相近。透蠟溫度要恒定，模具、樣品和石蠟之間溫差要一致，以保障石蠟充分包圍并支撐樣品。為了防止組織未包埋完就已凝固，故包埋溫度要略高，但溫度過高會導致組織收縮變硬變脆，不利于切片［9］。此外，新購臘塊可經多次反復加熱，使其包含的氣體蒸發。在包埋之前可用高溫將石蠟融化，再降低至需要的溫度，溫度一般比石蠟熔點高5℃ ～6℃即可。動物肝組織包埋溫度為62℃時效果較好。包埋操作要迅速，力求在最短時間內完成石蠟透入過程，以免引起組織變硬、變脆、收縮等［10］。浸蠟時間不宜過長，否則易造成組織塊脆硬，切片如豆腐渣樣。包埋后石蠟的迅速冷卻，可防止包埋塊中產生結晶以致切片碎裂等現象發生［11］。

6 染色

標本經石蠟包埋后切成4～5 μm厚的薄片，再經脫蠟后進行染色。蘇木素-伊紅染色法是石蠟切片常用的染色法之一，伊紅作為對比染色劑不應染得太紅，以免細胞核與細胞質難以區分，故染色時間不能太長;但也不能染得太淡，否則細胞質著色不完全，細胞質和細胞核紅藍對比不明顯，故染色時間也不能太短［12］。此外，染色還需注意:①加溫染色時溫度不應太高，過高則會使物理染色性增強，肝組織選擇50℃、染色5 min效果較好;②染色試劑應及時更換，避免有效成分減少;③分化時操作應在鏡下控制核的染色，防止分化液不起作用;④染色過程中所用乙醇、二甲苯等試劑常有染色劑混入影響染色效果，應定期更換避免染色劑的污染。染色結束進行封片，封片時中性樹膠滴加要適量，太少或過稀時均易出現空泡。封片后即可保存或在顯微鏡下觀察。綜上所述，組織切片質量的優劣，直接影響結果的判斷，而制作高質量的切片需要長期的摸索和改進。由于肝組織固有的特點，肝組織蠟塊在切片時較脆易碎，染色后鏡下結構常呈現斷裂現象，影響了肝組織原始結構的觀察。因此，不斷地分析總結肝組織石蠟切片制作的特點，探索肝組織制片的新技術和新方法，提高肝組織切片制作水平，對教學科研和臨床診斷工作具有重要意義。

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