葛根總黃酮對刀豆蛋白A誘導的小鼠免疫性肝損傷保護作用及其機制的初步研究

方士英，徐茂紅，趙克霞，張小勇，汪洋奎，顧宏霞，陳秀明，羅太敏

(皖西衛生職業學院1.藥學系、2.附屬醫院，安徽 六安 237000)

病毒性肝炎(viral hepatitis)是常見病、多發病，通過一系列的免疫應答可引起肝細胞損傷，其中以細胞免疫為主，特別是TNF-α大量釋放，可導致肝臟急性出血性壞死［1］。葛根是豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi.的干燥根，含多種黃酮類成分，具有解酒毒、降血脂等多種藥理活性［2］。本研究采用刀豆蛋白A誘導小鼠免疫性肝損傷模型，探討葛根總黃酮(TPF)的保護作用，以期為葛根總黃酮在病毒性肝炎等免疫性肝損傷中的應用提供依據。

1 實驗材料與方法

1.1材料昆明種小鼠，♂，體質量20～26 g，SPF級，購自安徽省實驗動物中心，合格證號為SCXK(皖)2011-001;葛根總黃酮:霍山野生葛根提取，安徽大別山葛業有限公司提供(總黃酮含量≥80%);聯苯雙酯(bifendate，BF):浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠(批號:090801);刀豆蛋白A(美國Sigma公司);考馬斯亮藍、MDA、SOD、ALT、AST 試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，批號分別為 20110402、20110623、20110624、20110624、20110620;IFN-γ、TNF-α 試劑盒為eBioscience公司產品;UV1200紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司;酶標儀(DNA9602)，北京普朗新技術有限公司。

1.2方法

1.2.1分組60只小鼠按體重隨機分為正常組、陽性藥組(BF，200 mg·kg－1)、模型組、TPF 高、中、低(200、100、50 mg·kg－1)劑量組(生藥量)，每組10只。

1.2.2造模按免疫性肝損傷造模方法［3］，模型組尾靜脈注射Con A生理鹽水液20 mg·kg－1，造成急性免疫性肝損傷模型。

1.2.3給藥BF組和TPF高、中、低劑量組按0.2 ml·(10 g)－1體重每日灌胃給藥1次，正常組和模型組每日灌胃等體積的生理鹽水溶液1次，連續灌胃10 d。末次灌胃后，除正常組尾靜脈注射生理鹽水外，其余各組均尾靜脈注射Con A生理鹽水液20 mg·kg－1。禁食8 h后，摘眼球取血離心，留取血清待檢。

1.2.4指標測定末次給藥禁食8 h后摘除眼球取血，離心15 min(3 000 r·min－1)，分離血清，測定血清中 ALT、AST值。取10%肝勻漿用同樣時間離心得上清液，測定上清液中 MDA、SOD、IFN-γ、TNF-α 含量，其中 IFN-γ、TNF-α 采用ELISA法測定。各項檢測嚴格按試劑盒標示方法操作。

1.3肝臟病理學觀察取相同部位肝組織，用福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，做石蠟切片，每例均進行蘇木精－伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肝組織的病理變化。

1.4統計學處理數據應用SPSS 11.0軟件包處理，實驗結果均以±s表示，組間顯著性用t檢驗及相關分析。

2 結果

2.1TPF對Con A致免疫性肝損傷小鼠血清中ALT、AST和 肝勻漿中MDA、SOD、IFN-γ、TNF-α的影響模型組小鼠與正常組比較差異有顯著性(P＜0.05);TPF高、中、低劑量組與模型組比較，其小鼠血清ALT、AST、肝勻漿中MDA、IFN-γ、TNF-α含量降低，差異有顯著性(P＜0.05);肝勻漿中SOD升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)。見Tab 1。

Tab 1 Influence of TPF on ALT，AST in serum and MDA，SOD，IFN-γ，TNF-α in liver homogenate of mice induced by Con A(±s，n=10)

#P＜0.05 vs model;*P＜0.05 vs control

Group Dose/mg·kg－1 Pro Control - 52.4 ±9.69 72.5 ±7.62 1.78 ±0.15 98.6 ALT/IU·L－1 AST/IU·L－1 MDA/μmol·g－1Pro SOD/kU· g－1Pro IFN-γ/μg·g－1Pro TNF-α/μg·g－1±10.1 0.31 ±0.07 0.43 ±0.11 Model - 171.0 ±27.0* 186.6 ±16.6* 6.53 ±0.21* 50.5 ±5.68* 0.78 ±0.31* 0.98 ±0.13*TPF 200 135.1 ±13.7# 77.6 ±23.1# 2.25 ±0.57# 70.5 ±7.34# 0.46 ±0.10# 0.52 ±0.18#100 153.0 ±11.6# 97.2 ±12.8# 2.35 ±0.87# 68.7 ±8.56# 0.60 ±0.26# 0.66 ±0.07#50 158.8 ±7.42# 113.7 ±6.60# 2.71 ±0.45# 64.3 ±7.82# 0.73 ±0.30# 0.72 ±0.05#BF 200 154.6 ±12.5# 96.5 ±15.1# 2.10 ±0.68# 67.4 ±8.72# 0.42 ±0.20# 0.64 ±0.15#

2.2TPF對Con A致免疫性肝損傷小鼠肝臟病理組織學的影響光鏡下可見，正常組小鼠肝組織結構清晰，肝小葉結構完整，中央靜脈周圍肝竇呈放射狀發散，匯管區未見炎細胞浸潤。模型組肝細胞腫脹，點狀變性壞死，散在脂肪滴。聯苯雙酯組和TPF高、中劑量組肝細胞腫脹較模型組減輕，炎細胞浸潤減少，肝細胞損傷程度減輕。

3 討論

目前，小鼠免疫性肝損傷的模型主要有卡介苗加脂多糖誘導、丙酸桿菌或痤瘡丙酸桿菌加脂多糖誘導以及Con A誘導等［3］。Con A誘發的小鼠急性肝損傷是篩選治療急性肝炎和暴發性肝衰竭藥物的較理想的動物模型［4］。本研究結果顯示，TPF各劑量組能降低小鼠血清中ALT、AST和升高肝勻漿中MDA水平，增強肝勻漿中重要的抗氧化酶SOD的活性，減輕肝臟的病理性損傷，表明TPF對Con A誘導的小鼠免疫性肝損傷具有保護作用。

Con A活化Th細胞后刺激Th細胞和巨噬細胞產生過量的IFN-γ、TNF-α 等細胞因子，其中 TNF-α 可激活核因子 κB誘導的TNF-α、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)及IFN－γ等細胞因子的轉錄，在Con A誘導的肝損傷中起主要介導作用，急性肝損傷時，血清中TNF-α含量升高。高水平TNF-α是引起肝細胞壞死的一種重要細胞因子，既可誘導肝細胞凋亡，也可以導致肝細胞壞死［5］。IFN-γ可介導 T細胞對巨噬細胞的激活，促進靜止的CD4+T細胞轉變為Th1細胞［6］，刺激巨噬細胞產生過量的TNF-α和IFN-γ，加速肝細胞的壞死。TPF各劑量組能明顯降低小鼠肝勻漿中 IFN-γ、TNF-α水平，因此，其對Con A誘導的小鼠免疫性肝損傷的保護作用機制可能與抗氧化和抑制細胞因子IFN-γ、TNF-α等表達有關。

［1］溫 清，董瑞謙.免疫系統臨床藥理學［M］.北京:化學工業出版社，2010:70 －2.

［1］Wen Q，Dong R Q.Clinical pharmacology of the immune system［M］.Beijing:Chemical Industry Press，2010:70 －2.

［2］王金鳳，薄華本，孟祥穎，等.葛花異黃酮對急性心肌梗死小鼠心肌的保護作用［J］.中國藥理學通報，2010，26(1):59 －62.

［2］Wang J F，Bo H B，Meng X Y，et al.The protection of isoflavones on myocardium in myocardial infarction mouse［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(1):59 －62.

［3］魏 偉，吳希美，李元建，等.藥理實驗方法學［M］.第4版.北京:人民衛生出版社，2010:1131－2.

［3］Wei W，Wu X M，Li Y J，et al.Methodology of pharmacological experiments［M］.4th ed.Beijing:People’s Medical Publishing House，2010:1131 －2.

［4］鄧利娟，李湛軍，羅 楹，等.Caspase抑制劑F1013對刀豆蛋白A誘導小鼠急性肝損傷的治療作用［J］.中國藥理學通報，2012，28(1):136 －9.

［4］Deng L J，Li Z J，Luo Y，et al.Therapeutical effect of the caspase selective inhibitor F1013 on ConA-induced acute hepatic injury in mice［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(1):136 － 9.

［5］王國棟，袁同洲，許 諾，等.銀杏葉提取物對枯否細胞表達腫瘤壞死因子-α 的影響［J］.吉林醫學，2012，33(1):10.

［5］Wang G D，Yuan T Z，Xu N，et al.Ginkgo biloba extract inhibits tumor necrosis foctor-α expression in Kupffer cells［J］.Jilin Med，2012，33(1):10.

［6］張樹涌，張 歌，曹 勇，等.復方桂術膠囊對小鼠Lewis肺癌的抑制及 TNF-α 和 IFN-γ 的影響［J］.中成藥，2011，33(6):1048.

［6］Zhang S Y，Zhang G，Cao Y，et al.The suppression of mice with Lewis lung neoplasms and the influence of TNF-α ，IFN-γ by Guizhu capsule［J］.Chin Tradit Pat Med，2011，33(6):1048.