PPARγ基因靶向shRNA真核表達載體的構建及表達

高 艷，占日新，劉麗麗，陳芳輝，李宙雪，張 盈，孔 瀅，黃起壬

(南昌大學藥學系藥理學與分子治療學實驗室，江西南昌 330006)

過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是一類由配體激活的轉錄因子，屬于核受體超家族成員，包括3種亞型:PPARα、PPARβ 和 PPARγ［1］。其中 PPARγ 與脂肪細胞分化、胰島素抵抗、能量代謝和胰島素的敏感性密切相關，表達于成纖維細胞、平滑肌細胞、乳腺細胞、脾臟的紅白髓質、骨髓前體細胞、單核細胞和巨噬細胞、肺泡及氣道上皮細胞和血管內皮細胞等細胞中［2－3］。關于PPARγ改善機體胰島素敏感性的機制研究，一直是人們關注的熱點之一。美國加州大學和瑞士洛桑聯邦理工學院的研究表明，敲除實驗鼠脂肪細胞內核受體共抑制因子(NCoR)可改善胰島素敏感性。NCoR存在于很多細胞中，是轉錄因子輔助調節蛋白，是主要的PPARγ的共抑制因子。敲除實驗鼠脂肪細胞內NCoR后，PPARγ磷酸化受阻，最后導致肝臟、肌肉和脂肪胰島素敏感性增加［4－5］。本實驗擬構建針對PPARγ基因的短發夾環狀小干擾RNA(shRNA)重組載體，并將其轉染到人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)，篩選出抑制效果最好的重組表達載體，為進一步研究PPARγ低表達對高糖誘導血管內皮胰島素抵抗及其敏感性的作用及機制奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1質粒、菌種與細胞株pGPU6/GFP/Neo質粒購自上海吉瑪公司;脂質體為LipofectamineTM2000;人臍靜脈內皮細胞株購自ATCC。

1.2工具酶及主要試劑限制性內切酶BbsⅠ和BamHⅠ購自美國NEB公司;限制性內切酶PstⅠ購自Promega公司;T4連接酶和DNA Marker購自TaKaRa公司;質粒小提試劑盒和DNA膠回收純化試劑盒購自Qiagen公司;Top10感受態細胞購自天根公司;DMEM培養基干粉購自Invitrogen公司;特級胎牛血清購自杭州四季青生物制品公司;Kanamycin購自Sigma公司;PPARγ多克隆抗體及HRP標記的二抗購自Cell Signaling公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術公司。

1.3引物設計及合成利用GenBank檢索人PPARγ mRNA系列(GenBank Accession:NM_138712)，根據siRNA設計原則，通過Ambion公司在線設計軟件輔助設計，使用Blast將選定的序列進行同源性分析，最后選出3條片段作為PPARγ基因干擾片段，設計shRNA模板中的 loop結構選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號，shRNA的轉錄終止序列采用TTTTTT結構。正義鏈模板的5'端添加了CACC與BbsⅠ酶切后形成的黏端互補;反義鏈模板的5'端添加了GATC與BamHⅠ酶切后形成的黏端互補;如果siRNA的第1個堿基不是G，則在CACC后補加個G。將合成的發夾結構寡核苷酸單鏈用無核酶水稀釋為濃度0.46 mmol·L－1。按照以下體系退火得到shRNA模板:1 μl正義鏈、1 μl反義鏈、48 μl TE(pH 8.0)共50 μl在PCR儀上按照如下程序進行退火處理:90 ℃ 4 min，80 ℃ 4 min，75 ℃ 4 min，70 ℃ 10 min，37℃ 20 min，10℃ 40 min，4℃保存。將退火后產物稀釋20倍，終濃度為 0.92 μmol·L－1用于連接反應。

1.4酶切和連接反應pGPU6/GFP/Neo載體按如下反應體系進行雙酶切:10 × NEB buffer 2 μl、100 × BSA 0.2 μl、pGPU6/GFP/Neo 1 μg、Bbs Ⅰ 0.8 μl、Bam HⅠ 0.5 μl、加無核酶水至20 μl，37℃酶切3 h。1%TAE瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠回收試劑盒回收。將退火片段與經雙酶切后的載體按摩爾比4∶1進行連接反應，置16℃連接16 h。

1.5重組質粒的轉化、篩選和鑒定將連接產物接種于Top10感受態細胞進行轉化，涂布到3 ml含Kanamycin(終濃度為4.62 μmol·L－1)的LB固體培養基平板上，37℃恒溫箱培養過夜，各挑取2個菌落，接種到含4.62 μmol·L－1Kanamycin的LB液體培養基中搖菌過夜。用質粒小提試劑盒抽提質粒，所得質粒用PstⅠ和BamHⅠ分別酶切鑒定。得到的重組質粒分別命名pGPU6/GFP/Neo-shRNAPPARγ1，2，3。將初步鑒定證實的細菌擴增培養，取1 ml菌液送天根生化科技(北京)有限公司進行測序鑒定，測序引物為T7，測序方向為正向測序。

1.6重組質粒轉染HUVECs取處于對數生長期的HUVECs，用胰酶消化后使用含血清和不含抗生素的正常培養基重懸為2×108～8×108個·L－1后，接種至6孔培養板上，待細胞生長至70% ～80%匯合時進行轉染。LipofectamineTM2000試劑和質粒比例為 10 μl∶4 μg，按照轉染試劑說明書進行轉染，6 h后換成高糖培養基(33 mmol·L－1)。轉染24 h時后熒光顯微鏡下觀察HUVECs綠色熒光的表達情況，觀察質粒的轉染效率。實驗分為空白對照組(Control組)、高糖組(IR組)、空質粒轉染組(IR+Non-silencing shRNA組)和重組質粒轉染組(IR+shRNAPPARγ 1，2，3 組)，每組重復3次。

1.7Western blot檢測PPARγ基因的蛋白表達轉染48 h后提取HUVECs總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。上樣量為40μg，經SDS-PAGE電泳后，PVDF膜印跡，室溫10%脫脂牛奶封閉2 h，加入PPARγ一抗(1∶500)孵育過夜，辣根過氧化物酶HRP標記的二抗孵育2 h，ECL化學發光顯色，X線片顯影、定影。ImageTool圖像分析軟件測定各條帶灰度值，以β-actin為內參照進行數據分析，計算抑制率，抑制率/%=(對照組－干擾組)/對照組×100%。

1.8統計學分析采用SPSS16.0統計分析軟件對實驗數據進行單因素方差分析，實驗數據比較采用t檢驗，所得數值以±s表示。

2 結果

2.1引物設計及合成根據siRNA設計原則，通過Ambion公司在線設計軟件輔助設計3條片段作為PPARγ基因干擾片段(Tab 1)，由寶生物工程(大連)有限公司合成。

Tab 1 Design there shRNA sequence for the synthesis of PPARγ gene

2.2重組質粒酶切鑒定用PstⅠ和BamHI分別酶切重組載體，質粒pGPU6/GFP/Neo的BamHⅠ和BbsⅠ酶切位點之間是PstⅠ的酶切位點;插入目的基因干擾片段之后，PstⅠ酶切位點被取代，故不能被PstⅠ所酶切，但可被BamHⅠ酶切開，條帶在5 100 bp左右(Fig 1)。

Fig 1 Restriction enzyme analysis of recombinant plasmid pGPU6/GFP/Neo

2.3重組質粒測序鑒定將篩選克隆送天根生化科技(北京)有限公司測序，結果顯示重組質粒測序鑒定shRNA編碼序列與設計的片段完全一致，表明載體構建成功(Fig 2)。

Fig 2 The sequencing result of recombinant plasmid of pGPU6/GFP/Neo-PPARγ-1，2，3

2.4重組質粒的轉染效率因為干擾質粒帶有EGFP片段，進入細胞后可以產生能被激發出綠色熒光的蛋白，所以可以據此判斷轉染效率。轉染效率/%=發出綠色熒光的細胞個數/明場中總細胞個數×100%，轉染效率為45%(Fig 3)。

Fig 3 Fluorescence microscope restructuring recombinant plasmid transfected HUVECs(×100)

2.5重組質粒中PPARγ蛋白的表達Western blot檢測結果顯示(Fig 4)，IR組與Control組相比差異具有顯著性(P＜0.01);IR組和Non-silencing shRNA組間相比無差異(P＞0.05);shRNAPPARγ1和shRNAPPARγ2組與IR組相比無差異(P＞0.05)，無干擾效應;shRNAPPARγ3組與IR組相比差異有顯著性(P＜0.05)，說明轉入 PPARγshRNAPPARγ3后，抑制了PPARγ基因的表達，使PPARγ蛋白在高糖誘導下轉錄生成減少。

Fig 4 Western blot control to detect the expression of PPARγ protein

3 討論

過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)是類固醇/甲狀腺素核受體超家族成員之一，與NF-κB及活化劑蛋白-1(AP-1)等因子關系密切［6－7］。PPARγ可在體內體外調節基因轉錄和細胞分化，在脂肪形成、糖脂代謝及免疫系統中發揮重要作用，并且與糖尿病、肥胖、高血壓、癌癥等的發生發展有關，但是在血管內皮細胞中PPARγ對胰島素抵抗的作用機制還未完全闡明。

胰島素抵抗是指胰島素的靶器官對生理濃度的胰島素反應減弱，是2型糖尿病的重要發病因素。胰島素抵抗是代謝綜合征的中心環節，PPARγ對糖代謝的調節主要是增加外周組織對胰島素的敏感性，從而改善胰島素抵抗［8］。有研究表明［9］，PPARγ功能受損會導致嚴重的胰島素抵抗，而合成的PPARγ激動劑噻唑烷二酮類藥物包括曲格列酮(troglitazone)、羅格列酮、吡格列酮可以有效改善2型糖尿病患者的胰島素敏感性并降低血糖。PPARγ增加胰島素敏感性的機制可能是:磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)是靶細胞介導葡萄糖進入細胞內的關鍵性激酶，PPARγ在PI3K信號通路中可以促進PI3K基因表達，增強胰島素的敏感性，還可增強葡萄糖轉運體4(GluT4)基因表達，促進對葡萄糖的攝取［10］;PPARγ活化可以加速甘油三酯在外周組織的分解和抑制轉錄因子Pax6的活性，抑制胰高血糖素的生成和表達，改善胰島素抵抗［11］。

RNAi技術具有快速、高效、便于操作等優點，被廣泛應用到基因功能研究、基因表達調控機制研究等熱門領域［12］。本實驗應用RNAi技術，成功構建了PPARγ低表達質粒，并成功篩選出了沉默效果最好的重組表達載體。為進一步研究PPARγ低表達對高糖誘導胰島素抵抗及其敏感性的作用及機制奠定了基礎。

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