黃芩苷及三七總皂苷配伍腦脊液藥代動力學研究

楊雁芳，李 智，王 磊，王永炎，張文生

(1.北京師范大學地表過程與資源生態國家重點實驗室，北京 100875;2.北京大學藥學院，北京 100191;3.中藥資源保護與利用北京市重點實驗室，北京 100875;4.天然藥物教育部工程研究中心，北京 100875)

黃芩苷是中藥黃芩的主要有效成分，具有解熱［1］、抗炎［2］、抗氧化［3］、免疫調節［4］等作用，近年來文獻報道具有保護腦缺血/再灌注損傷［5－7］、保護神經細胞等作用［8－9］。三七總皂苷是中藥三七的主要活性物質，具有較強的活血祛瘀、通經活絡作用。“毒損腦絡”是王永炎院士提出的中醫腦病病機理論［10］，黃芩和三七是解毒法和通絡法治療腦病的常用藥物，黃芩苷和三七總皂苷是其主要有效成分，在腦內的代謝過程決定著藥效發揮。本文采用HPLCMS/MS法測定靜脈注射給藥后黃芩苷在大鼠腦脊液的分布，同時研究了三七總皂苷配伍對黃芩苷在大鼠腦脊液中分布的影響。

1 材料

1.1藥品與試劑黃芩苷提取物(山東省諸城市浩天藥業有限公司，批號YZ20090307，經HPLC測定黃芩苷含量為0.92);三七總皂苷(購自云南云科藥業有限公司，經HPLC測定含人參皂苷Rb10.31、人參皂苷Rg10.32、三七皂苷R10.05);黃芩苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110715-200815，含量0.95);卡馬西平對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號100142-201004，含量0.99);乙腈(色譜純，美國 J.T.Backer)，甲醇、乙酸銨、甲酸、氨水(分析純，北京化工廠)。

1.2儀器3200 Q TRAP質譜儀(Analyst 1.4.2數據處理軟件，美國Applied Biosystem公司);Agilent 1100液相色譜儀(美國Agilent公司)。

1.3動物Wistar大鼠，♂，體質量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。實驗前禁食過夜，飲水不限。

2 方法

2.1藥品配制精密稱取黃芩苷提取物8 g，加入生理鹽水200 ml，并用NaOH溶液調節pH至7.5，使黃芩苷充分溶解，得到40 g·L－1的黃芩苷溶液。精密稱取黃芩苷提取物8 g，三七總皂苷10.4 g，同上法配制得到黃芩苷40 g·L－1、三七總皂苷52 g·L－1的配伍溶液。配制藥品置4℃冰箱保存備用。

2.2給藥與采樣取健康清潔級Wistar大鼠80只，隨機分成黃芩苷單獨給藥組(BA)和黃芩苷－三七總皂苷合并給藥組(BA-PNS)，每組40只大鼠。將每個給藥組的大鼠隨機分成8個時間點，每個時間點5只。按黃芩苷100 mg·kg－1、三七總皂苷130 mg·kg－1的劑量尾靜脈注射分別給予黃芩苷溶液和黃芩苷三七總皂苷配伍溶液。

分別在給藥后不同時間點(5、15、30、60、120、240、360、480 min)將大鼠麻醉(按 6.7 ml·kg－1的劑量腹腔注射質量分數為1%的戊巴比妥鈉溶液)并俯臥，剪開大鼠頭頸部背側皮膚，鈍性剝離覆蓋在枕骨上的肌肉，充分暴露環枕膜，將連有PE管的針頭刺入枕骨大孔，PE管的另一側用100 μl微量注射器緩慢抽取，可見有澄清的腦脊液被緩緩抽出，后段如有血液則棄去不用。將腦脊液樣品置－80℃冰箱保存備用。

2.3腦脊液樣品預處理取大鼠腦脊液20 μl，加入 1 mg·L－1卡馬西平溶液4 μl，加入甲醇56 μl，渦旋振蕩1 min，14 000 r·min－1離心10 min 后取上清液，進樣。

2.4分析方法液相條件:色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動相:A 為乙腈，B 為1 mmol·L－1乙酸銨(含 0.1% 甲酸)，C 為0.1%氨水，梯度洗脫程序見Tab 1;流速:1.0 ml·min－1;進樣量:20 μl;柱溫:25℃。

質譜條件:多反應監測(MRM);電噴霧離子源;離子模式:正負離子切換，0.00～3.71 min，黃芩苷［M －1］－(445/269)，離子源電壓 －4 500 V，解簇電壓－45 V;3.71～6.50 min，卡馬西平［M+1］+(237/194)，離子源電壓5 500 V，解簇電壓70 V。

Tab 1 Gradient program of determination of baicalin in rat brain by HPLC-MS

2.5質控樣品的制備取空白腦脊液20 μl，加入1 mg·L－1卡馬西平溶液4 μl和一定體積的黃芩苷溶液(黃芩苷的終濃度依次為 10、100、160 μg·L－1)，加入甲醇補足至80 μl，余按“2.3 腦脊液樣品預處理”方法操作后進樣。

2.6標準曲線繪制取空白腦脊液20 μl，加入1 mg·L－1卡馬西平溶液4 μl和一定體積的黃芩苷溶液(黃芩苷的終濃度依次為 5、10、30、100、200 μg·L-1)，加入甲醇補足至80 μl，余按“2.3腦脊液樣品預處理”方法操作后進樣測定。以黃芩苷和卡馬西平的色譜峰峰面積比值Y為縱坐標，對照品濃度X(μg·L－1)為橫坐標進行線性回歸。

2.7含藥腦脊液樣品測定黃芩苷單獨給藥組和黃芩苷－三七總皂苷合并給藥組的大鼠腦脊液樣品的處理方法同“2.3”。樣品測定方法同“2.4”。

2.8數據處理實驗數據用 DAS 2.0版藥動學軟件擬合計算各項藥動學參數。

3 結果

3.1方法專屬性在采用的色譜和質譜條件下，黃芩苷和內標卡馬西平的全掃描質譜見Fig 1，樣品測定結果見Fig 2。黃芩苷和內標卡馬西平分離良好，腦脊液中的內源性物質不干擾黃芩苷和內標物卡馬西平的測定。

Fig 1 Full-scan mass of baicalin and carbamazepine(IS)

3.2標準曲線與線性范圍大鼠腦脊液中黃芩苷的標準曲線:Y=2.84e－0.05X+0.000193(r=0.9905)，線性范圍為 5 ～ 200 μg·L－1。最低定量限為 5 μg·L－1。

3.3回收率實驗取低、中、高3個濃度的質控樣品進行測定，每個濃度平行操作3份，用工作曲線計算濃度，以實際濃度為對照，計算回收率，見Tab 2。黃芩苷在腦脊液中的回收率在87.15%～92.73%范圍內。

Fig 2 MRM of baicalin and Carbamazepine(IS)in rat CSF determination by HPLC-MS

3.4精密度實驗取低、中、高3個濃度的質控樣品進行測定。每個濃度的樣品連續進樣3次，計算相對標準差RSD，測定日內精密度。每個濃度的樣品連續3 d，每天進樣，測定日間精密度。結果見Tab 2。腦脊液中黃芩苷的日內和日間精密度RSD均小于5%。

Tab 2 Recovery and precision of baicalin in rat CSF(±s，n=3)

Tab 2 Recovery and precision of baicalin in rat CSF(±s，n=3)

Added/μg·L －1 RSD/%10 9.27 ±0.74 92.73 ±7.41 7.98 9.97 ±0.11 1.06 9 Recovery Determined/μg·L －1Recovery/% RSD/%Intra-day precision Determined/μg·L－1RSD/%Inter-day precision Determined/μg·L －1.57 ±0.45 4.75 100 90.70 ±5.34 87.34 ±3.27 3.75 96.05 ±0.72 0.75 92.50 ±2.63 2.84 160 139.31 ±4.16 87.15 ±2.52 2.89 145.33 ±1.531.05 143.33 ±5.03 3.51

3.5穩定性實驗將低、中、高3個濃度的質控樣品置于4℃冰箱中放置72 h，每24 h測定1次，測定結果RSD為2.00% ～4.78%，表明該保存條件下黃芩苷穩定性良好。

3.6實驗組腦脊液樣品中黃芩苷的藥代動力學大鼠尾靜脈注射黃芩苷以及黃芩苷－三七總皂苷配伍溶液后，黃芩苷在腦脊液中的分布濃度數據見Tab 3。腦脊液分布濃度－時間曲線見Fig 3。藥代動力學參數見Tab 4。

Fig 3 Concentration-time curves of baicalin in rat CSF after intravenous administration(±s，n=5)

Tab 3 Mean concentration of baicalin in rat CSF after intravenous administration(±s，n=5)

Tab 3 Mean concentration of baicalin in rat CSF after intravenous administration(±s，n=5)

Time/min BA/μg·L －1 BA+PNS/μg·L －1 189.33 ±20.60 237.06 ±51.86 15 134.90 ±42.74 64.80 ±34.19 30 23.17 ±11.75 22.70 ±13.17 60 13.01 ±6.35 12.22 ±8.09 120 10.38 ±2.62 11.11 ±1.34 240 7.06 ±1.60 4.65 ±1.30 360 3.89 ±2.20 2.00 ±1.79 5 480 1.04 ±1.51 0.83 ±0.97

Tab 4 Pharmacoknetic parameters of baicalin in rat CSF after intravenous administration(±s，n=5)

Tab 4 Pharmacoknetic parameters of baicalin in rat CSF after intravenous administration(±s，n=5)

Parameters BA BA+PNS Tmax/min 55 Cmax/μg·L －1 189.67 ±20.13 237.00 ±51.86 AUC0-t/μg·min·L －1 6612.96 ±1023.65 5466.63 ±267.06 AUC0-∞ /μg·min·L－1 6930.43 ±1060.41 5682.13 ±412.79 T 12/min 108.84 ±45.67 102.54 ±38.37 Ke/min －1 0.0071 ±0.0027 0.0073 ±0.0023 CL/L·min－1·kg－115.39 ±2.60 18.32 ±0.88

4 討論

文獻有報道測定兔［11］和大鼠［12］腦脊液中黃芩苷含量的HPLC-MS方法，但在本實驗中均未能達到很好的測定效果。本文建立的HPLC-MS-MS法測定條件可以將黃芩苷和內標卡馬西平很好分離，且腦脊液中的內源性物質不干擾測定，方法學考察均符合要求。

不同文獻對黃芩苷透過血腦屏障的能力有不同的結論。與上述文獻建立了腦脊液中黃芩苷含量的測定方法不同，王冰［13］、Tsai等［14］認為黃芩苷不能透過血腦屏障進入腦脊液和腦組織，本課題組前期工作通過Discovery Studio軟件預測認為黃芩苷透過血腦屏障的能力并不確定［15］，因此黃芩苷的腦脊液藥代動力學研究很有意義。本實驗結果證實，靜脈注射黃芩苷后可以迅速進入大鼠腦脊液，且消除速度較快。

近年來中藥的腦脊液藥代動力學越來越受到重視，配伍對中藥有效成分代謝的影響也成為一個新的研究方向。從本實驗和三七總皂苷配伍前后黃芩苷的藥代動力學參數來看，達峰時間Tmax均為5 min，峰濃度Cmax分別為(189.67±20.13)和(237.00±51.86)μg·L－1、曲線下面積 AUC0-t分別為(6612.96±1023.65)和(5466.63±267.06)μg·min·L－1、AUC0-∞分別為(6930.43 ± 1060.41)和(5682.13 ±412.79)μg·min·L－1、半衰期分別為(108.84±45.67)和(102.54±38.37)min、消除速率Ke分別為(0.0071±0.0027)和(0.0073±0.0023)min－1、清除率CL 分別為(15.39 ±2.60)和(18.32 ±0.88)L·min－1·kg－1，差異均無顯著性，說明合用三七總皂苷后黃芩苷的腦脊液代謝無明顯變化，證明三七總皂苷對黃芩苷進入腦脊液沒有影響。但其他實驗數據表明，三七總皂苷對黃芩苷的血液藥代動力學和腦組織分布有明顯影響(另文發表)，說明三七總皂苷通過影響黃芩苷體內的組織分布而改變其代謝過程，具有一定的臨床指導意義。

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