華法林個體化用藥的研究進展

葛蓓蕾 田陸云 王 紅 (昆明醫科大學第一附屬醫院，云南 昆明 650032)

華法林(warfarin)是20世紀40年代合成的香豆素類口服抗凝血藥，目前被廣泛應用于多種疾病的抗凝治療，如瓣膜病、瓣膜置換、非瓣膜病性房顫、電復律、冠心病、肺栓塞和深靜脈血栓形成等〔1〕。但華法林治療范圍窄，臨床療效和不良反應個體差異很大，劑量很難掌握，即使很小的劑量也可能會導致出血，抗凝不足又會導致血栓的形成。因而限制了其在臨床上的應用。近年來隨著分子生物學領域的快速發展，基因多態性的研究給華法林臨床個體化用藥帶來希望。

目前對華法林個體劑量差異相關基因的研究大致從以下兩類著手:一類是影響藥物代謝動力學，編碼藥物代謝酶和負責轉運的基因，如細胞色素氧化酶P450(CYP)、有機陰離子轉運子等;一類是影響藥物效應動力學，編碼藥物作用的靶點、血漿轉運蛋白等的基因，如 VKORC1、載脂蛋白E、γ-谷氨酰羧化酶(GGCX)、微粒體環氧化物水解酶(mEH)等。

1 華法林的藥物代謝

華法林在體內是被不同的CYP同工酶通過羧基化而代謝成非活性產物的。臨床上所用的華法林制劑為消旋混合物，為S-華法林對映體和R-華法林對映體混合物。不同類型的華法林對映體代謝酶、代謝產物也不同。S-華法林對映體經CYP2C9酶催化生成無活性6-7羥華法林;而R-華法林對映體則由 CYP1A1、CYP1A2、CYP3A4 酶代謝〔2〕。其中 CYP3A4 將R-華法林催化生成無10-羥華法林，此為R-華法林代謝的主要成分。S-華法林其抗凝活性是R-華法林的3～5倍〔3〕。由此可以看出CYP2C9是影響華法林代謝的主要酶之一。

1.1 CYP2C9多態性及等位基因的突變頻率 細胞色素P450(CYP450)是參與許多內外源性物質代謝的單加氧酶，位于細胞內質網膜上，由 CYP基因超家族編碼。最大的家族是CYP2〔4〕，目 前 已 經 分 離 出 CYP2C8、CYP2C9、CYP2C10、CYP2C17、CYP2C18及CYP2C19。其中CYP2C9基因編碼的蛋白在人肝微粒體中含量豐富，約占CYP450總量的20%，僅次于CYP3A，催化了約16%〔5〕的臨床常用藥物。

大量研究表明CYP2C9在人類存在幾種等位基因突變體，其中最主要的有3種:野生型 CYP2C9*1、CYP2C9*2和CYP2C9*3。突變體是CYP2C9*2和CYP2C9*3，其編碼的酶活性比野生型CYP2C9*1降低了30%和80%〔6〕，CYP活性降低的患者，華法林在體內代謝速度減慢，導致有效血藥濃度升高，進而使藥物療效增強。因此CYP2C9基因突變體需要華法林劑量較低。攜帶這兩個等位基因的個體服用華法林后需要較長的時間才能達到穩態血藥濃度，并且在使用初期出血危險性較高。CYP2C9*2和CYP2C9*3等位基因頻率有較大的種族差異。白種人中突變發生率高于黃種人和黑人，在白種人中CYP2C9*2型突變率在10%以上，意大利人達到12.5%，亞洲人中這種突變率非常低。CYP2C9*3型突變在白種人中發生率在7.5% ～10%，亞洲人中約 3%〔7〕。其他突變如:CYP2C9*4，CYP2C9*5，CYP2C9*6 以及 CYP2C9*11等在人群中突變頻率很低，華法林劑量的影響還有待于研究〔8〕。

1.2 CYP2C9 多態性與華法林劑量 Kamali等〔9〕報道CYP2C9基因多態性會影響華法林的劑量，如純合子(*1/*1，n=74)所需劑量為(4.06±1.72)mg，雜合子(*1/*2，n=30)為(3.63±1.78)mg，雜合子 (*1/*3，n=15)為(2.70±1.36)mg。Sanderson等〔10〕在 CYP2C9 與華法林多態性的研究中指出有20%的病人有等位基因變異，CYP2C9*2型平均日華法林劑量減少了0.85 mg，CYP2C9*3型減少了1.92 mg，CYP2C9的基因型在華法林的臨床應用中有很大的意義。中國人華法林代謝主要與CYP2C9*1和CYP2C9*3有關，馬量等〔11〕報道CYP2C9.Leu359基因變異與華法林并發癥的關系。報道表明CYP2C911e.359 Leu 359的突變會減慢S-華法林的代謝，攜帶該突變的病人容易出現出血等并發癥，此類病人應用華法林的劑量要小。華人華法林維持劑量比印度人低，在印度的華人，除CYP2C9*3突變體外，還發現了更多的變異，如在CYP2C9啟動子、外顯子、內含子也發現了突變〔12〕。

2 華法林的作用機制

華法林通過抑制維生素K環氧化物還原酶，阻止維生素 K還原形式(KH2)的形成。KH2通過對維生素K依賴性凝血因子 Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ氨基末端谷氨酸殘基的γ-羧化作用，使其具有生物活性。在羧化形成過程中，耦聯氫醌型維生素K被氧化成環氧型維生素K。使維生素K依賴性凝血因子前體被持續羧化成有活性的凝血因子。體內環氧型維生素K還原為氫醌型維生素K由維生素環氧化物還原酶復合體(VKORC)完成，VKORC是維生素K依賴性凝血因子生成的限速酶〔13〕，同時VKORC由VKORC1激活。VKORC1不但主導維生素K依賴性凝血因子的生成，而且是香豆素類抗凝藥物華法林的作用靶點〔14〕。目前，對華法林作用機制影響的基因研究熱點集中在VKORC1。

2.1 VKORC1基因多態性與等位基因頻率 VKORC1位于16號染色體上，其產物維生素K環氧化物還原酶亞單位1，位于內質網膜上。很多研究顯示VKORC1基因多態性比CYP2C9基因多態性更能顯示華法林個體劑量差異，它不但可以解釋華法林的個體差異還可以解釋種族差異。目前對VKORC1多態性的研究集中在啟動子-1639A/G，內含子1173C＞T和3'非編碼區的3730G＞A。

臺灣學者Yuan等〔14〕一項研究發現，啟動子區-1639A＞G多態性與華法林劑量有關。AA，AG，GG3種基因型在中國患者中的分布頻率分別為:79.7%、17.6%及2.7%，對華法林敏感的均為-1639AA基因型，對華法林抵抗的與-1639GG和GA基因型相關。而在白種人中分別為:14%、47%及39%。這兩種人種中AA基因型頻率的差異與臨床上發現的華法林維持劑量差異相一致。Lee研究〔15〕指出，在中國，馬來西亞和印度人中華法林需求劑量的不同可以用民族間VKORC1基因型的不同來解釋。VKORC1基因序列上存在10種基因突變，據此命名為H1～H9的單倍體模型，發現H1突變與華法林劑量減少有關，而H7、H8、H9突變與華法林劑量增加有關。H1突變在中國人、馬來西亞人分別占87%、65%，在印度人中占12%。H7、H8、H9突變在中國人、馬來西亞人分別占9%和30%，而印度人占82%，這三者和華法林的劑量差異相符。

2.2 VKORC1基因多態性與華法林劑量 D'Andrea等〔16〕提出兩個常見的多態現象，即位于內含子1的1173C＞T和3'非編碼區的3730G＞A能影響華法林個體劑量。在不考慮其他變異存在的情況下，1173CC基因型華法林劑量(6.2 mg/d)比CT或者TT基因型(4.8 mg/d)高。同時研究也發現位于內含子區的1173C＞T的突變與VKORC1-1639A/G突變存在著強烈的連鎖不平衡效應，對華法林敏感的-1639AA基因型同時也是1173TT純合子的基因型，對華法林抵抗的-1639AG同時也是1173TC基因型，-1639GG也與1173CC連鎖。1639G＞A啟動子還與 6484C＞T(rs9934438)，6853G＞C(rs8050894)和7566C＞T(rS2359612)有很明顯的連鎖不平衡〔17〕。

臺灣學者Yuan等〔14〕的研究顯示在要達到相同抗凝強度時，華法林劑量也就隨著基因型的不同而出現了差異，-1639AA基因型對華法林敏感，華法林需求劑量≤1.5 mg/d，而-1639AG或者-1639GG對華法林抵抗，華法林需求劑量≥6.0 mg/d。他們推斷這是由于VKORC1-1639A/G變異導致該啟動子活性不同，VKORC1 mRNA表達量不同，引起VKORC1蛋白量不同，進而導致華法林個體劑量差異。

3 其他多態性與華法林劑量之間的關系

載脂蛋白E(ApoE)基因共有4個外顯子，其產物主要在肝臟和小腸合成。ApoE存在于乳糜微粒殘粒中，并在其代謝過程中作為受體與配體結合，協助VitK轉運至肝臟〔18〕。ApoE最主要的3個表型E2、E3和E4相對應的是4號外顯子的3種基因型，分別為2、3、4。不同的等位基因變異對華法林劑量的影響取決于它們在這個人群中的突變頻率，這受種族的影響。例如ε4基因型對華法林需求劑量影響很小，臨床相關性小，在亞洲人群中其基因型頻率比高加索人和美國人要低〔19〕。多變量回歸分析顯示在抗凝治療人群中，病人的年齡、體重、CYP2C9、VKORC1、APOE基因的多態性可以顯著預測華法林劑量(R=57%)。但是ε4基因僅能解釋2%華法林個體劑量差異。

γ-谷氨酰羧化酶(GGCX)基因有15個外顯子，其基因產物GGCX蛋白是一種微粒體膜酶，存在于粗面內質網和高爾基體上。GGCX催化VitK依賴的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ，以及蛋白C和S的谷氨酸殘基翻譯后的γ-羧化，此羧化過程與隨后進行的還原型VitK氧化過程相耦聯，氧化型VitK又被VKORC1所還原。Wadelius等〔20〕研究了GGCX基因的14個單核苷酸多態性(SNP)，發現位于2號內含子的SNP與華法林的劑量密切相關，其他單倍型與華法林的劑量無明顯相關性。另外有研究顯示〔21〕，VKORC1基因多態性顯著影響華法林個體劑量，CYP2C9*3、*2中等程度的影響華法林個體劑量。其他基因無影響或僅有很小的影響，這些基因包括編碼GGCX，各種凝血因子、環氧化物水解酶(mEH)、CYP的各種亞型，某些谷胱甘肽轉移酶、APOE、蛋白C。至于CYP4F2，意義很小，CYP4F2突變的病人華法林劑量約增加0.5 mg/d。作者指出除了CYP2C9和VKORC1，其他常見的單核苷酸基因多態性很少影響華法林的個體劑量。因此有關此兩個基因有待進一步研究。

4 基因型和抗凝反應之間的聯系

華法林的代謝受很多病理、生理和環境因素的影響，但多項研究顯示:遺傳因素在華法林個體反應差異中起決定性的作用。華法林在起始治療時常會出現過度抗凝，尤其是老年人，隨著年齡的增長，肝臟合成凝血因子能力減退，VitK的攝入與吸收減少;CyP450酶含量及活性下降;同時由于并存疾病及合并用藥，出血傾向明顯，華法林的劑量應相應減少。一項研究表明〔22〕攜帶CYP2C9突變體的病人，INR值高于治療范圍的比率較高，需要較長的時間才能達到維持劑量，危及生命的出血風險率較野生型高。另一項研究證明〔23〕，CYP2C9*2或者CYP2C9*3雜合子和純合子與野生型相比華法林劑量低，過度抗凝導致出血的風險率增加。由此我們認識到基因型與嚴重出血有關，我們應關注基因型和其他因素對華法林個體差異的影響，從而進行更有針對性的個體化治療。

Sconce等〔24〕通過對年齡、體重、CYP2C9 和 VKORC1基因型變量進行分析，可以解釋55%華法林需求劑量的差異。一項瑞典人的研究顯示〔25〕，在起始治療時，純合子的 CYP2C9和VKORC1等位基因突變會增加過度抗凝的風險。CYP2C9、VKORC1、年齡、性別、藥物間相互作用的多重回歸分析可以解釋59%的華法林個體劑量差異。非遺傳因素可以解釋17%～22%的劑量差異。CYP2C99，VKORC1 CC，VKORC1 TC聯合年齡體重可以解釋亞洲人60.2%的華法林劑量差異〔26〕。

華法林的臨床個體用藥差異是由多種因素決定的，除了基因影響華法林劑量差異外，環境、飲食也是華法林個體劑量差異的因素。盡管CYP2C9、VKORC1、臨床和病人因素不能完全解釋華法林劑量需求的個體差異，但很多研究顯示通過CYP2C9、VKORC1基因型劑量方程的建立仍然可以提高華法林劑量的準確性，減少經驗性用藥所帶來抗凝不足或過度抗凝的風險，提高個體抗凝治療安全性。未來遺傳藥理學的臨床應用要求藥物劑量與遺傳學、臨床和病人因素結合起來，以更好地指導個體化用藥，從而使臨床用藥更具針對性、高效性和安全性。

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