阿爾茨海默病生物標記物的研究進展

魏 艷 謝兆宏 許繼平 畢建忠 (山東大學第二醫院神經內科，山東 濟南 250033)

阿爾茨海默病(AD)是一種慢性進行性神經系統變性疾病，是最常見的癡呆類型，其發病率逐年增加，在許多國家已成為主要的公共衛生問題。據統計，目前全球超過7 000萬人有不同程度的癡呆，其中AD超過50%〔1〕。雖然近年來對AD的發病機理有了深入了解，但其確切的病因和發病機制仍不清楚。目前診斷仍以臨床和神經心理學評估為基礎，若要確認診斷，與其他原因的癡呆鑒別，正如美國神經病學及語言障礙和卒中研究所——AD及相關疾病深地(NINCDS-ADRDA)標準的要求，需要病理學或遺傳學支持。然而，AD發病有較長的臨床前期，可為治療提供一個時間窗，以延緩或阻止病情進展，因此AD的早期治療很重要，關鍵在于早期診斷。

早期生物標記物不僅可以提高診斷的準確性，還可監控AD的神經退變和疾病進展程度，評價治療效果。在AD的研究過程中，生物標記物不僅可以補充最初傳統的神經心理和影像等指標，還可能會提示抗癡呆藥物的重要作用機理。因此，開發并研究AD的生物標記物具有重要的臨床及現實意義。理想的AD生物標記物應當可以檢測神經病理學的基本特點，其敏感性和特異性均應超過80%，還應具有可靠，可重復性好，無創，易實施等特點〔2〕。尋找AD的生物學指標應圍繞其基本病理過程如老年斑(senile plaques，SP)的形成、細胞內神經纖維纏結(neurofibrillary tangles，NTFs)、氧化應激、炎癥反應、脂質代謝異常、血管病變等進行。

1 β-淀粉樣蛋白(Aβ)相關的生物學標記物

AD的典型病理變化之一老年斑是Aβ、早老素、載脂蛋白E(ApoE)等在細胞外組成的相對不可溶解的5～10 nm厚的淀粉樣纖維，周圍有萎縮的軸突、反應性星形膠質細胞和激活的小膠質細胞，其中Aβ是SP的主要成分。Aβ主要在神經元產生，來自于淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein，APP)溶蛋白性裂解的產物。可溶性的Aβ在血液和腦脊液中都有發現，這使得Aβ及其相關代謝產物有希望成為候選標記物。這些生物學標記物包括APP亞型、β－淀粉樣前體蛋白裂解酶1(β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1，BACE1)、Aβ亞型、Aβ自身抗體和Aβ寡聚體等。

1.1 APP亞型 因外周循環的APP 95%以上存在于血小板中，故血小板中APP異構體蛋白的代謝變化受到廣泛關注。大量研究表明〔3〕，血小板APP異構體在AD的發病過程中起重要作用，其降解產生的Aβ聚合體可以損傷突觸和神經元。Zainaghi等〔4〕通過Western印跡方法來測定分析AD患者、輕度認知功能障礙(Mild cognitive impairment，MCI)患者和正常老年對照外周循環血中血小板APP130-和110-片段的含量比值(APP異構體比值)，發現與MCI和正常對照組相比，AD患者中此比值顯著降低，而MCI與正常對照組之間卻并無顯著差異，由此提示APP作為AD候選標記物的可能性。但由于技術上的局限性及不易于大樣本檢測，與血漿中Aβ水平研究相比，該研究較少受人注重。

1.2 BACE1 BACE1啟動Aβ的生成，成為AD主要的治療靶點。越來越多的證據〔2〕顯示，隨著AD病情的發展，患者大腦BACE1水平也會隨之升高。Devi等〔5〕通過比較BACE1敲除小鼠和AD轉基因小鼠模型，發現敲除小鼠BACE1基因不僅可以在早期豁免記憶力下降，延緩海馬中區膽堿能神經變性現象，還能顯著降低 Aβ42和β-分泌酶水解產生的 C-末端(C99)。Mulder等〔6〕研究發現，BACE1在腦脊液中的活性與AD患者大腦病理變化相關。上述研究結果提示BACE1對AD的早期診斷是很有價值的。但是，目前的研究僅限于小樣本，尚未見大樣本、多中心的臨床研究，因此，BACE1能否成為可靠的AD的生物學標記仍有待進一步研究。

1.3 Aβ亞型 Aβ并不是一個單分子，而是一系列含有不同氨基酸的分子肽家族，其中Aβ42和Aβ40是SP的主要成分，另外，在人體液中還至少可測得6種 Aβ亞型，包括 Aβ37，Aβ38，Aβ39，Aβ41 等〔7〕。目前為止研究較多的是腦脊液及血漿中Aβ42和Aβ40兩種亞型。

1.3.1 腦脊液Aβ亞型 腦組織中Aβ的聚集和沉積是AD最主要的病理學特征，提供了Aβ亞型成為AD標記物的可能性。到目前為止〔2〕，已經報道了30多個有關腦脊液中Aβ42含量的分析研究。大多數結果表明，AD患者腦脊液中Aβ42的含量與正常對照組相比降低50%，在鑒別AD與正常對照的平均敏感性與特異性都高于85%，而且發現在精神疾病，如抑郁癥，和其他一些神經疾病，如帕金森病(Parkinson's disease，PD)和核上性麻痹等，腦脊液中Aβ42均處于正常水平。然而，有1%的額顳葉癡呆和血管性癡呆中可以發現輕到中度降低，這提示了腦脊液Aβ42在AD與其他神經精神疾病方面鑒別的特異性，但單一應用Aβ42尚不足以應用于AD與其他神經退化機制的癡呆鑒別。因此，應該注重腦脊液Aβ42與其他標記物一起聯合應用，尤其是Aβ42與tau蛋白聯合，在AD早期有很高的敏感性、特異性和預測價值，可以用來當作AD臨床前期的標記物。

與Aβ42相比，AD患者腦脊液中Aβ40的含量則不變或略有增加，但多數研究表明Aβ42/Aβ40比值降低，這種降低比Aβ42水平的降低更顯著，此兩項指標的聯合應用對AD早期診斷更有意義。隨著研究的深入，越來越多的Aβ亞型被發現。最近 Mulugeta〔8〕通過對 AD、路易體癡呆(dementia with Lewy bodies，DLB)、PD 和非癡呆對照組的研究發現，Aβ42/Aβ38 比值在鑒別 AD與 DLB方面最佳，敏感性達到78%，特異性67%。此項研究表明雖然單一的測量結果缺乏準確性，但腦脊液Aβ38與Aβ42聯合應用有助于AD與DLB的鑒別診斷。這使得Aβ38成為潛在的AD生物標記物，其確切的應用價值還有待于進一步研究。

1.3.2 血漿Aβ亞型 雖然腦脊液是最理想的檢測標本，但由于其樣本采集的有創性而影響了其廣泛應用，因而研究血液中AD的生物標志物就具有重要意義。新出現的證據〔9〕顯示腦脊液和血漿中的Aβ通過受體介導的雙向運輸而達到一個動態平衡，血漿中Aβ含量在一定程度上可以反應Aβ的代謝程度。研究發現在家族性AD患者中，發病以前血漿Aβ水平表現為升高，隨著病情的進展而漸下降。而最近的研究發現，Aβ40含量的升高及Aβ42含量的降低和癡呆的風險性之間是有關聯的。在一項縱向研究中〔10〕，通過對AD門診病人4年以上的隨訪，發現血漿Aβ40、Aβ42含量及超敏C-反應蛋白的變化與進展的認知功能障礙是相關的，表明血漿Aβ與其他潛在標記物聯合應用可提高其敏感性和特異性。但也有研究表明，血漿Aβ濃度值在AD和正常人間重疊很多，在AD診斷上不具有充分的敏感度和特異性，但有可能作為評價AD發病危險性和發病前檢查的方法。

隨著對Aβ研究的深入，新型研究標本相繼被發現。Bermejo-Pareja等〔11〕通過對AD、PD患者及正常對照的研究比較，通過超敏ELISA試劑盒測定其唾液和血漿中的Aβ水平，發現輕度AD患者唾液中雖然Aβ42含量的升高幅度很少，但仍有其統計學意義，而PD與正常對照之間此含量就沒有差別。研究表明，唾液Aβ42有希望成為AD的外周標記物，有助于鑒別AD與其他神經退化性疾病，但確定其診斷意義尚需更多的研究結果來驗證。

2 tau蛋白

tau蛋白是存在于神經軸突中的微管相關性蛋白，在人類大腦中有6種不同的亞型，存在多個磷酸化位點。1995年Arai等成功地用ELISA方法測定腦脊液中總tau蛋白(total tau protein，t-tau)含量，與對照組相比，AD與其他神經退化性疾病患者腦脊液中t-tau顯著升高〔12〕。之后，許多學者都致力于研究t-tau與AD發病及病情進展之間的關系，探討其作用機制。至今，有超過50項的研究證明，用ELISA方法測定的AD患者腦脊液中t-tau與對照組相比升高將近3倍，其敏感性和特異性均超過80%。雖然在發病早期就存在t-tau的升高，但t-tau升高水平與疾病進程無關〔13〕。而且，也有研究發現，在其他類型的癡呆，如血管性癡呆患者中，也發現t-tau含量升高。在一些神經退化性疾病，如PD、進行性核上麻痹和Pick病等，也偶爾會有t-tau含量升高。因而，在慢性神經變性疾病的研究中，常用腦脊液t-tau蛋白含量反映神經變性和損害的程度。

AD細胞內的NTFs主要由雙螺旋纖維聚集而成，研究表明病理性的雙螺旋纖維主要是由過度磷酸化tau蛋白(phosphorylated tau protein，p-tau)組成，患者腦中NTFs數量可以作為臨床檢測AD程度的一個重要指標，提示了p-tau作為AD生物標記物的可能性。腦脊液中p-tau的含量反應患者大腦t-tau磷酸化的水平。對于非特異性腦損傷如急性腦卒中，p-tau含量不如t-tau升高明顯，而克-雅氏病(CJD)患者腦脊液t-tau水平雖有顯著升高，但p-tau水平卻沒有變化〔14〕。這些發現表明腦脊液p-tau水平不像t-tau蛋白僅僅是神經損害的一個指標，最重要的是它反映了腦t-tau的磷酸化狀態與AD患者NTFs的形成，在AD和其他疾病的鑒別診斷方面，p-tau有更高的靈敏度和特異性。不同位點磷酸化的tau蛋白在AD的鑒別診斷方面又各具特異性，如P-tau231在鑒別AD與額顳葉癡呆方面特異性較強，而p-tau181可用于AD與DLB的鑒別，在區分AD患者和血管性癡呆方面，p-tau199的特異性則比p-tau181更強〔15〕。

由于血漿中tau蛋白含量低于可測量的閾值，所以到目前為止，關于外周血液循環中tau蛋白含量的數據仍然很少，對于AD患者腦脊液tau水平的升高是否可能引起血液中tau水平的升高仍然不清楚，所以需要更多的研究來證實和擴展。

3 氧化應激標記物

隨著年齡的增長，氧化應激損傷產生的代謝產物堆積，引發細胞損傷及神經元的凋亡，也是AD發病的重要危險因素。相關研究表明〔16〕，晚期糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycation endproducts，RAGE)是Aβ的特異性受體，通過與Aβ結合增強神經元氧化應激水平，使RAGE表達增多，尤其在Aβ聚集區。免疫組化研究〔17〕發現，AD患者大腦RAGEs明顯高于正常人，而RAGEs也主要集中在NTFs中。上述研究提示，氧化應激學說在AD發病機制中處于重要地位，它與Aβ沉積學說、tau蛋白理論、炎性損傷學說等均緊密關聯。氧化應激不僅是AD的早期事件，而且在AD進展的各期均表現顯著。臨床上定期監測外周血中特定氧化應激標志物的水平，及時應用抗氧化治療，對于早期AD患者的認知功能可能有明顯改善。

異構前列腺素(isoprostane)是自由基介導的多不飽和脂肪酸過氧化的產物，雖然它不具備神經毒性，但是在AD患者腦脊液中發現F2-異構前列腺素水平升高。在一項縱向研究過程中〔18〕，AD患者腦脊液F2-異構前列腺素水平顯著升高，而在應用抗氧化藥物后，其水平明顯降低。但是，血漿中F2-異構前列腺素水平在AD與MCI患者之間沒有明顯差別，提示血漿中此物質作為標記物意義不大。關于血漿中F2-異構前列腺素能否作為標記物仍需要更多的研究來確認。

4 炎癥反應標記物

目前為止，已有諸多研究〔13〕確認免疫炎性機制參與AD的發病進程，SP中Aβ的沉積與活化的小膠質細胞和星形膠質細胞表達炎性蛋白、神經調節因子如IL-6等有關。血漿炎癥標志物，如白細胞介素(IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α及急性時相蛋白如C-反應蛋白是血管性癡呆的標志物，在AD及血管性癡呆臨床發病前增加。此外，Teunissen等〔19〕研究顯示IL-12、IL-16、IL-18和TNF-β水平在輕度AD患者中較高，但在嚴重AD患者和非癡呆年齡相關配對組中無顯著差異。

5 脂質代謝標記物

膽固醇代謝異常、脂蛋白a的不同亞型和水平變化、ApoE對膽固醇代謝的調節以及ApoE自身與Aβ的相互作用等已經被證實與AD的發生有密不可分的關系。ApoE蛋白是極低密度脂蛋白的主要成分，參與膽固醇通過血腦屏障的運輸，其編碼基因ApoEε4是目前為止唯一確認的散發AD的遺傳學危險因素。與對照組相比〔9〕，ApoEε4等位基因在 AD與 MCI患者中表達率升高，其致病作用取決于它在膽固醇代謝中的作用。有縱向研究表明ApoEε2等位基因是AD的保護性因素，其作用可能與ApoEε4作用相反，而ApoEε3等位基因在AD的發生發展過程中起中性作用。

6 結語

近年來國內外對AD早期診斷的生物標記物進行了廣泛研究，一致認為對于AD，發病機制復雜的疾病，聯合應用多種不同代謝途徑的標記物可以增強診斷的敏感性與特異性。腦脊液中 Aβ40，Aβ42，p-tau等生物學標記物，尤其是 Aβ42與tau蛋白的聯合應用對于AD的早期診斷有一定的幫助。但是，腦脊液樣本的采集是一種有創性技術，限制了其廣泛應用，而血液樣本的采集則具有無創、快速、方便等優點，但是到目前為止尚沒有接近澳大利亞國家會計協會(NIA)標準的血漿標記物，尤其是在敏感性與特異性方面達不到要求。因此，研究血液中AD生物標記物則更具有現實應用意義。隨著對AD發病機制的深入研究及相關技術的發展，開發高靈敏性和特異性的生物標記物將具有重要意義。

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