缺血后處理對大鼠缺血再灌注后海馬CA1區神經元內蛋白伴侶的影響

李光民 葛鵬飛 孟繁凱 楊 穎 王光明 羅毅男 (吉林省人民醫院神經外科，吉林 長春 3002)

缺血后處理對大鼠缺血再灌注后海馬CA1區神經元內蛋白伴侶的影響

李光民 葛鵬飛1孟繁凱 楊 穎1王光明1羅毅男1(吉林省人民醫院神經外科，吉林 長春 130021)

目的 探討缺血后處理對短暫腦缺血后海馬CA1區神經元內蛋白伴侶的影響。方法 采用大鼠全腦缺血模型。Wistar大鼠分為缺血組及缺血后處理組，每組按照再灌注時間進一步分為12 h恢復組、24 h恢復組、48 h恢復組及72 h恢復組。采用HE染色光鏡觀察腦缺血后神經元死亡;差速離心結合蛋白印跡分析短暫腦缺血后蛋白伴侶hsp70和hsp40在細胞內數量的變化。結果 HE染色顯示缺血后處理顯著降低了腦缺血再灌注后海馬CA1區神經元死亡;蛋白印跡分析顯示，缺血后處理顯著提高了hsp70的表達，同時還降低了缺血再灌注所致的hsp40的減少。結論

缺血后處理能夠顯著減少腦缺血后海馬CA1區神經元內hsp70和hsp40的含量，進而抑制蛋白聚集物的形成，降低了缺血再灌注后海馬CA1區神經元死亡。

缺血后處理;腦缺血再灌注;蛋白伴侶hsp70;蛋白伴侶hsp40

缺血后處理是指在腦缺血結束后，反復地間斷性阻斷腦血流的恢復，進而達到腦保護的目的〔1〕。近年研究發現，缺血后處理對腦缺血再灌注所致的神經元延遲性死亡的保護作用與其能夠降低氧化應激反應、激活細胞內的信號傳導途徑有關〔2〕，但是其對腦缺血再灌注過程中蛋白伴侶的影響尚不清楚。蛋白伴侶是一類功能上相互關聯，具有輔助蛋白質折疊作用的一類特殊蛋白質，可以防止或抑制不具有正常結構的蛋白彼此聚集在一起形成細胞毒性作用的蛋白聚集物〔3〕，而蛋白聚集物被認為是導致腦缺血后神經元死亡的重要病理基礎之一〔4〕。本研究采用大鼠全腦缺血模型，探討缺血后處理對海馬CA1區神經元內蛋白伴侶的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 雄性 Wistar大鼠，280～320 g，80只，吉林大學實驗動物部提供。分為腦缺血組、后處理組;每組又分為假手術組，12 h恢復組，24 h恢復組，48 h恢復組及72 h恢復組。每組8只，其中4只用于蛋白印跡分析，4只用于蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.1.2 實驗試劑及設備 抗熱休克蛋白70(hsp70)及hsp40多克隆抗體(美國Cell signaling公司)，蛋白質濃度測定試劑盒(美國Bio-Rad公司)，ECL(美國Amersham公司)，其他試劑均購自美國Sigma公司。聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國Millipore公司)，膠片(美國Kodak公司)。電泳槽及電泳儀購自美國Bio-Rad公司。激光掃描共聚焦顯微鏡為德國產Zeiss LSM 510型;震動切片機為德國產Leica VT-1000S型。

1.2 方法

1.2.1 全腦缺血模型的制作 采用雙側頸總動脈暫時夾閉法。動物禁食一夜，隨意飲水。先以5%(30%O2，70%N2O)氟烷誘導麻醉，然后以2%濃度維持麻醉。尾動脈插管監測動脈血壓，同時注射0.05 ml(150 IU/kg)肝素。右側股動脈插管備用。頸部正中直切口，分離雙側頸總動脈。顳肌下和直腸內分別插入熱敏探頭，監測頭溫和體溫;手術過程中用恒溫毯將頭溫和體溫保持在36.8℃ ～37.2℃。缺血時先用動脈瘤夾夾閉雙側頸總動脈，經股動脈抽血將動脈壓降至50 mmHg后再進行缺血，缺血時間為15 min。缺血結束后，除去動脈瘤夾并將血液回輸。

1.2.2 缺血后處理方法 腦缺血結束后，松開動脈瘤夾恢復腦供血30 s，再夾閉雙側頸總動脈阻斷腦供血30 s;如此反復，3個循環后完全解除頸動脈夾閉，徹底恢復腦供血。

1.2.3 腦組織固定 將大鼠麻醉、氣管插管后連接呼吸機，以3%氟烷維持麻醉，打開胸腔，暴露心臟，左心室內注射0.1 ml(300 IU/kg)肝素后，將導管經左心室插入主動脈，先以4℃磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3 min，然后用4℃含有4%多聚甲醛的PBS液灌注3 min，取出腦組織，放于含有4%多聚甲醛的PBS液中固定24 h(4℃)。

1.2.4 HE染色 將載有腦片的載玻片放置于背光處陰干，用梯度乙醇溶液脫水后置于蘇木素溶液中15 s，沖洗干凈后，放入Scott溶液中10 s，沖洗后放入伊紅溶液中10 s，再經乙醇溶液脫水后進行透明處理，加蓋玻片。在高倍顯微鏡下選擇海馬CA1區進行觀察，同時對存活的神經元進行計數。

1.2.5 胞質蛋白組分的分離 大鼠麻醉后，迅速斷頭，分離海馬CA1區腦組織，液氮冷凍保存。將腦組織稱重后，按照重量體積比1∶10加入勻漿緩沖液〔1.5 mmol/L Tris-HCl pH7.6，1 mmol/L DTT，0.25 mol/L 蔗糖，1 mmol/L MgCl2，1.25 μg/ml pepstatin A，10 μg/mlleupeptin，2.5 μg/mlaproptonin，0.5 mmol/L PMSF，2.5mmol/LEDTA，1mmol/LEGTA，0.1 mol/L Na3VO4，50 mmol/L NaF，2 mmol/L 焦磷酸鈉〕，勻漿器抽壓35次。勻漿組織液以4℃ 6 500 r/min離心20 min，抽取上清用于分離胞質蛋白組分(分離條件為4℃ 75 000 r/min離心1 h，上清即為含有胞質蛋白的組分)。Bradford法測定含有胞質蛋白組分的蛋白濃度后，保存于－20℃冰箱備用。

1.2.6 蛋白印跡分析 十二烷基硫酸鈉-聚乙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳。0.45 μm PVDF膜濕法電轉膜。室溫下3%牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h。置于搖床上與抗hsp40多克隆抗體4℃下孵育過夜。室溫下與二抗孵育1 h。再與化學增強發光法(ECL)一起孵育1 min，然后經過曝光，顯影，沖洗，定影等步驟。用Kodak ID軟件測定每一個條帶的灰度值。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 缺血后處理具有保護短暫腦缺血后神經元延遲性死亡的作用

HE染色顯示缺血再灌注后72 h，海馬CA1區神經元幾乎全部死亡，死亡的神經元胞質粉染，胞核固縮深染，呈現多角形。然而缺血后處理組則有部分神經元存活。統計發現，缺血組僅有5.21%±1.21%的神經元存活;而后處理組存活的神經元則高達55.32% ±5.34%，二者之間差異顯著(P＜0.01)。

2.2 缺血后處理能夠顯著提高蛋白伴侶hsp70的表達

蛋白印跡分析顯示，缺血組海馬CA1區神經元內蛋白伴侶hsp70的表達在再灌注后12 h、24 h和48呈顯著提高;但是，缺血后處理能夠進一步提高使海馬CA1區神經元內蛋白伴侶hsp70的表達，二組之間具有顯著性差異。

2.3 蛋白伴侶hsp40在細胞質內含量的變化

蛋白印跡分析顯示：缺血組海馬CA1區神經元內蛋白伴侶hsp40的含量在再灌注后24 h和48 h顯著下降;相比之下，缺血后處理減少了hsp40的下降，兩組之間具有顯著性差異。

3 討論

對于蛋白聚集物形成的機制，目前較普遍的觀點是，細胞受到應激刺激后，一方面細胞內新合成的蛋白質會產生錯誤折疊;另一方面，細胞內的蛋白質會發生解鏈而變性〔5〕。這兩類異常蛋白質都不具有正常的空間結構，使本應該位于蛋白質內部的疏水集團暴露在外面，這些具有黏性的疏水基團彼此粘連在一起形成細胞毒作用的蛋白聚集物〔6〕。蛋白聚集物可以沉積在胞質中，也可以黏附在線粒體和高爾基體等膜性細胞器上，影響細胞的正常生命活動，最終導致細胞死亡〔7〕。

細胞內每時每刻都有異常蛋白生成，但細胞內并不形成蛋白聚集物，這是因為細胞內存在蛋白質量控制系統能夠監控細胞內形成的異常蛋白，并及時地將其清除掉〔8〕。蛋白伴侶是細胞內蛋白質質量監控系統的重要組成部分，能夠輔助蛋白質的折疊、促進其降解、抑制蛋白聚集物的形成。在蛋白伴侶中，hsp70是可誘導的蛋白伴侶，主要位于胞質中，能夠識別并與新合成的、部分折疊的以及解鏈的蛋白質結合，促進它們的折疊或者降解〔9〕。Hsp40具有三方面的作用：①能夠與異常蛋白上的疏水基團相結合防止形成蛋白聚集物〔10〕;②能夠與hsp70協同作用，將異常蛋白轉運至蛋白降解系統，如蛋白酶體〔11〕;③能夠調節hsp70的功能，具有輔助和增強hsp70的作用〔12〕。

本研究結果顯示，缺血后處理的腦保護作用與其能夠調節胞質內蛋白伴侶hsp70和hsp40的含量有密切的關系。作為應激性蛋白伴侶，hsp70在腦缺血再灌注過程中雖然有顯著性表達，但是由于hsp40在再灌注后24 h和48 h顯著性減少，導致二者不能協調發揮抑制蛋白聚集物形成的作用。與出血組比較，缺血后處理不僅能夠顯著提高海馬CA1區神經元內蛋白伴侶hsp70的表達，還能保持腦缺血后蛋白伴侶hsp40在神經元的含量，進而促進了hsp70和hsp40的協同作用，增強了其對蛋白聚集物形成的抑制作用，發揮了腦保護作用。

綜上所述，缺血后處理對腦缺血再灌注后海馬CA1區神經元的保護作用與其能夠改善蛋白伴侶hsp70和hsp40在神經元內的含量有密切關系。這為缺血后處理的腦保護作用提供了一個新的機制。

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The effects of ischemic postconditioning on chaperones in the CA1 neurons suffered transient ischemia and reperfusion

LI Guang-Min，GE Peng-Fei，MENG Fan-Kai，et al.
Jilin Province People's Hospital，Changchun 130021，Jilin，China

Objective To investigate the effects of ischemic postconditioning on the chaperones in the CA1 neurons suffered transient ischemia and reperfusion.Methods Transient global ischemia rat model was established.Following different reperfusion period，all the Wistar rats were divided into ischemia and ischemic postconditioning groups.Each group was divided further into sham-operation，12，24，48 and 72 h recovery groups.Differential centrifuge and Western blotting analysis were used to analyze the quantitative alterations of hsp40 and hsp70.Results HE staining showed that ischemic postconditioning reduced neuronal death induced by transient ischemia and reperfusion.Western blotting analysis showed that the expression of hsp70 was upregulated，and the content of hsp40 in CA1 neurons was improved by ischemic postconditioning.Conclusions Ischemic postconditioning could improve the quantities of hsp70 and hsp40 in the CA1 neurons，and reduce neuronal death in the CA1 region caused by ischemia and reperfusion.

Ischemic postconditioning;Cerebral ischemia reperfusion;Chaperone hsp70;Chaperone hsp40

R749

〕 A

〕 1005-9202(2012)22-4936-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.22.038

國家自然科學基金資助項目(No.30973110);吉林省科技廳資助項目(No.200805122)

1 吉林大學第一醫院神經外科

楊 穎(1984-)，男，在讀碩士，主要從事腦膠質瘤的外科治療研究。

李光民(1955-)，男，主任醫師，主要從事腦血管病機制及外科治療研究。

〔2012-01-10收稿 2012-02-16修回〕

(編輯 袁左鳴)