奧曲肽聯(lián)合多西他賽對(duì)胃癌細(xì)胞抑制作用的研究

申 申

遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，遼寧錦州 121000

臨床和基礎(chǔ)研究均表明生長(zhǎng)抑素類似物奧曲肽（OTC）不僅能抑制多種內(nèi)分泌激素分泌，而且對(duì)多種腫瘤生長(zhǎng)也具有抑制作用，可作為聯(lián)合用藥方案的基礎(chǔ)。 多西他賽(DOC)為紫杉醇類抗腫瘤藥物，單藥或聯(lián)合其它化療藥在進(jìn)展期胃癌的治療中已顯示了較明顯的優(yōu)勢(shì)。 現(xiàn)應(yīng)用奧曲肽聯(lián)合多西他賽干預(yù)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)，驗(yàn)證奧曲肽對(duì)多西他賽是否有增敏作用。

1 材料與方法

1.1 材料與實(shí)驗(yàn)試劑

SGC-7901，多西他賽(20 mg，0.5 mL )，生長(zhǎng)抑素類似物奧曲肽，胎牛血清，RPMI.1640 干粉培養(yǎng)基，胰酶，四甲基偶氮唑鹽(MTT)，二甲基亞砜(DMSO)，碘化丙啶（PI），33258 熒光染料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 奧曲肽、 多西他賽及聯(lián)合用藥對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響 該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)奧曲肽藥物分組濃度為1、5、20 ng/ mL; 多西他賽濃度為1、5、10、20、40 ug/mL。 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌SGC-7901 細(xì)胞，胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/ mL，每孔種200 uL 細(xì)胞懸液于96 孔培養(yǎng)板內(nèi)，同時(shí)設(shè)立細(xì)胞對(duì)照組、奧曲肽處理組（1、5、20ng/mL）、多西他賽處理組（1、5、10、20、40 μg/mL）、聯(lián)合用藥組（奧曲肽+多西他賽1ng/mL+1μg/mL、1 g/mL+5 μg/mL、1 ng/mL+10 μg/mL、1 ng/mL+20 μg/mL、1ng/mL+40 μg/mL、5 ng/mL+1μg/mL、5 ng/mL+5 μg/mL、5 ng/mL+10 μg/mL、5 ng/mL+20 μg/mL、5 ng/mL+40 μg/mL 、20 ng/mL+1 μg/mL、20 ng/mL+5 μg/mL、20 ng/mL+10 ng/mL、20 ng/mL+20 μg/mL、20 ng/mL+40 μg/mL）每組設(shè)8 個(gè)復(fù)孔。置37℃、5%CO2飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)。于48 h 后取出96 孔板，2000 rpm 離心10 min， 超凈工作臺(tái)無(wú)菌條件下棄去上清，加200 uL/孔R(shí)PMI.1640 培養(yǎng)液及20 ul/孔MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h， 取出后2000 rpm 離心10 min， 棄去上清液， 加150 uL/孔DMSO 震蕩10 min 混勻，待溶解完全后酶標(biāo)儀比色，波長(zhǎng)570 nm。計(jì)算各組濃度抑制率。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期 根據(jù)MTT 比色法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果取抑制率最高濃度組，設(shè)立不加藥對(duì)照組、奧曲肽20 ng/mL組、多西他賽40 μg/mL 組、聯(lián)合用藥奧曲肽20 ng/mL+多西他賽40 μg/mL 組，以胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901 細(xì)胞，將細(xì)胞收集到含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為105/mL，取2 mL 細(xì)胞種于6 孔板孔內(nèi)培養(yǎng)24 h，后分別以預(yù)設(shè)藥物處理細(xì)胞24 h，1500 rpm 離心5 min 棄上清，再用PBS 洗兩次， 離心棄上清，PBS 懸浮細(xì)胞， 緩慢滴加70%冷乙醇邊滴加邊旋攪防止細(xì)胞結(jié)塊成團(tuán)，于－20℃固定至少24 h，而后離心棄乙醇，用PBS 洗去乙醇，離心棄上清，1 mL PI 熒光染料孵育30 min，采用流式細(xì)胞儀，進(jìn)行檢測(cè)。 重復(fù)3 次。

1.2.3 Hoechest33258 熒光染色檢測(cè) 取普通潔凈蓋玻片于濃硫酸-重鉻酸鉀清潔液中浸泡過(guò)夜，自來(lái)水洗滌5 遍，蒸餾水沖洗10 遍，于70%乙醇中浸泡24 h，紫外燈照過(guò)夜，無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)吹干。 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，105/mL 密度接種于放有蓋玻片的6 孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%以上融合，設(shè)不加藥為對(duì)照組、奧曲肽20 ng/mL 組、多西他賽40 μg/mL 組、聯(lián)合用藥奧曲肽20 ng/mL+多西他賽40 μg/mL 組，分別處理細(xì)胞48 h，以甲醇∶冰醋酸(3∶1)4℃固定5min，PBS 漂洗， 用終質(zhì)量濃度為5 mg/L Hoeehst33258熒光染料避光染色10 min，PBS 漂洗后滴抗熒光粹滅封片液封固;熒光顯微鏡下觀察拍照。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 MTT 法檢測(cè)藥物對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901 細(xì)胞增殖的抑制作用

以1、5、20 ng/mL OCT 分別作用胃癌細(xì)胞SGC-7901 48 h后，MTT 結(jié)果顯示，OCT 對(duì)SGC-7901 增殖有抑制作用， 抑制作用隨著藥物濃度而增強(qiáng)，呈劑量依賴方式，不同濃度之間抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 流式細(xì)胞儀分析聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞周期及凋亡的影響

OCT 作用SGC-7901 細(xì)胞24 h 后， 經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)可出現(xiàn)輕度S 期阻滯，并出現(xiàn)典型的凋亡峰（sub-G1），提示OCT 可通過(guò)凋亡途徑抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901 生長(zhǎng)。 DOC 作用于SGC-7901 細(xì)胞24 h 后， 經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)可出現(xiàn)明顯G2 /M 期阻滯，凋亡峰明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），提示DOC 亦可通過(guò)凋亡途徑抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901 生長(zhǎng)。

2.3 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

Hoechst33258 熒光染色后， 熒光顯微鏡下可見(jiàn)對(duì)照組的SGC-7901 細(xì)胞核比較完整均一，著色較淡，形態(tài)較規(guī)則，呈均勻的藍(lán)色熒光，經(jīng)奧曲肽作用細(xì)胞48h 后，細(xì)胞核偶有凋亡形態(tài)變化，經(jīng)多西他賽作用48 h 后，熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞大小不等，有典型的凋亡形態(tài)改變，細(xì)胞體積縮小、細(xì)胞質(zhì)濃縮、細(xì)胞核染色質(zhì)聚集，并有核碎裂及凋亡小體。 聯(lián)合用藥組可見(jiàn)大部分細(xì)胞質(zhì)染色不均勻，染色質(zhì)凝聚，細(xì)胞核裂解，可見(jiàn)凋亡小體。

3 討論

胃癌在我國(guó)為最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，治療上采用以手術(shù)治療為主，輔以放化療等輔助治療。 化療可有效抑制和殺滅胃癌細(xì)胞，以減少?gòu)?fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，提高患者生存期，改善生存質(zhì)量。 以單一藥物化療效果較差，有效率僅為20%～30%，而聯(lián)合不同作用的多種藥物則可將有效率提高到30%～50%。 因聯(lián)合用藥不但可以殺死更多癌細(xì)胞，使患者進(jìn)入緩解期，而且可以有效減少腫瘤產(chǎn)生對(duì)某種藥物的耐藥性， 所以較單一用藥更受臨床醫(yī)師青睞。

該實(shí)驗(yàn)顯示：奧曲肽與多西他賽聯(lián)合組腫瘤細(xì)胞抑制率與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在正常血藥濃度下奧曲肽與多西他賽聯(lián)合可提高腫瘤抑制率， 奧曲肽對(duì)多西他賽有增敏作用，與奧曲肽濃度無(wú)關(guān)，提高多西他賽對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用，提示可減少多西他賽臨床用藥量。 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期顯示奧曲肽對(duì)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期有輕微阻滯作用，并可誘發(fā)腫瘤凋亡。 多西他賽對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用明顯，可阻滯細(xì)胞周期與G2/M 期，誘發(fā)凋亡作用更明顯，與奧曲肽聯(lián)合應(yīng)用后，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡比率更高，顯示出更優(yōu)越的抗腫瘤效果。 故奧曲肽與多西他賽聯(lián)合應(yīng)用于胃癌治療可減少多西他賽臨床應(yīng)用劑量，從而減少多西他賽不良反應(yīng)。 奧曲肽在體內(nèi)的半衰期較短，代謝速度很快，該實(shí)驗(yàn)證實(shí)常規(guī)用藥劑量下，在血藥濃度變化范圍內(nèi)奧曲肽對(duì)多西他賽均有增效作用，提高了抗腫瘤治療的臨床應(yīng)用效果。 另一方面，因奧曲肽對(duì)胃腸血流有減少作用，如先于多西他賽給藥，將降低多西他賽在胃腸組織內(nèi)的濃度，對(duì)抗腫瘤治療產(chǎn)生不利影響，但當(dāng)多西他賽進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，即進(jìn)入效應(yīng)室后，其濃度衰減較慢，此時(shí)如給予奧曲肽，將減少胃腸血流量，減少多西他賽于胃腸組織中的清除，理論上亦可提高多西他賽抗腫瘤效果。

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