siRNA下調RRM2抑制人乳腺癌細胞增殖與遷移及其裸鼠皮下移植瘤的生長

郭紹文， 林 韻， 李澤民△

(1上海中醫藥大學附屬曙光醫院病理科，上海200021;2上海市東方醫院腫瘤科，上海200120)

核糖核苷酸還原酶 (ribonucleotide reductase，RR)是RNA合成的前體，參與核糖核苷酸還原成脫氧核糖核苷酸的過程，在核苷酸代謝過程中發揮中心作用，是唯一催化核糖核苷酸轉化為脫氧核糖核苷酸的酶，是 DNA合成和修復的限速酶［1］。人的RR包括2個亞基，即RRM1和RRM2，這2個亞基在不同的染色體上被不同的基因編碼，由不同的mRNA表達。

RR的活性主要受RRM2表達水平的調節［2］，RRM2在很多腫瘤中都高表達［3］，而RRM2的高表達往往與腫瘤的化療耐受［4］、侵襲能力強［5］和預后差［6］關系密切，這些研究提示RRM2可能是治療腫瘤的一個潛在的靶點。

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發病率占全身各種惡性腫瘤的7% ～10%，而有關以RRM2為靶點治療乳腺癌的研究報道并不多，因此，本課題利用RNA干擾技術［7］，評價了下調RRM2基因后人乳腺癌細胞系MCF－7體外的增殖和遷移情況及其體內成瘤能力，以期為乳腺癌的基因治療提供有意義的理論依據。

材料與方法

1 材料和試劑

1.1 細胞系及小鼠 人乳腺癌細胞MCF－7和人正常乳腺上皮細胞MCF－10A購自美國標準生物品收藏中心 (ATCC)，由本實驗室凍存。MCF－7于DMEM培養液 (含10% 胎牛血清、青霉素1×105U/L和鏈霉素100 mg/L)，MCF－10A于DMEM/F12培養液 (5% 胎牛血清，20 μg/L EGF，500 μg/L 氫化可的松，100 μg/L胰島素和2 mmol/L L－谷氨酰胺)，兩細胞都是 37℃、5%CO2孵箱內培養。BALB/c裸鼠18只，雌性，5周齡，體重約20g，購自上海實驗動物資源中心。

1.2 主要試劑及儀器 鼠抗人RRM2單抗購于Abcam;辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的人GAPDH抗體購于上海康成生物工程有限公司;Cell Counting Kit－8(簡稱CCK－8)試劑盒購于Dojindo。Western blotting試劑盒購于 Sigma。總RNA提取試劑 Trizol、RT－PCR試劑盒 (大連TaKa-Ra)。CO2培養箱 (NU－3500)，倒置熒光顯微鏡(Olympus)，實時定量熒光PCR儀 (ABI7500)。

2 方法

2.1 siRNA設計 RRM2小干擾 RNA(siRNARRM2，序列參照文獻［8］報道)及陰性對照 (siRNA－NC)由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，見表1。

表1 合成的siRNA－RRM2及陰性對照siRNA序列Table 1.The chemically synthesized sequences of siRNA －RRM2 and negative control siRNA

2.2 siRNA轉染 按Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑說明書進行操作，取對數生長期細胞，待細胞密度達到70%～80%的融合度時于6孔板中分組轉染:空白對照組(NEG，加PBS)、陰性對照組(siRNA－NC)和實驗組 (siRNA－RRM2)。轉染8 h后更換為新鮮的相應培養液。

2.3 Real－time PCR檢測mRNA表達 用Trizol一步抽提法提取細胞總RNA［9］，用TaKaRa RT試劑盒反轉錄成cDNA。RRM2正義鏈5＇－GCTTGGTCGACAAGGAGAAC －3＇和反義鏈 5＇－CCTCTGCCTTCTTATACATCTG －3＇。人 GAPDH 正義鏈5＇－ GCTGAGTACGTCGTGGAGTC－3＇和反義鏈 5＇－AGGCATTGCTGATGATCTTG－3’。寡核苷酸引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。按照SYBR Green System(TaKaRa)試劑盒說明進行PCR擴增，反應程序為:95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環。以人GAPDH作為內參照，比較閾值法計算目的基因相對表達。

2.4 細胞遷移實驗 MCF－7細胞以每孔1.5×105鋪于24孔板，過夜。siRNA轉染8 h，胰酶消化后無血清培養基種于孔徑8 μm的Transwell小室中，孔底加10%FCS的培養液。48 h后，用棉簽擦凈未遷移的細胞，后用結晶紫染色，熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.5 CCK－8法檢測細胞增殖

2.5.1 劑量效應 取對數生長期細胞接種于96孔板(每孔1×104個細胞)，轉染3個濃度(50 nmol/L、150 nmol/L和300 nmol/L)的siRNA－RRM2和陰性對照siRNA－NC，并設空白組，轉染48 h后吸取培養液，PBS洗2遍后每孔加入100 μL CCK－8混合液 (含10 μL CCK－8試劑，90 μL相應培養液)繼續孵箱培養2 h后，酶標儀450 nm測定吸光度值。

2.5.2 時間效應 取對數生長期細胞接種于96孔板 (每孔1×104個細胞)，轉染siRNA－RRM2(終濃度150 nmol/L)和陰性對照siRNA－NC(終濃度150 nmol/L)，并設NEG組和空白孔組，分別于轉染24、48、96 h后吸取培養液，PBS洗2遍后每孔加入100 μL CCK －8 混合液 (含 10 μL CCK －8 試劑，90 μL相應培養液)繼續孵箱培養2 h后，酶標儀450 nm測定吸光度值。

繪制細胞生長曲線。根據公式:細胞增殖率 =(NEG組－處理組)/NEG組－空白孔組，計算增殖率。

2.6 Weatern blotting檢測蛋白表達 細胞鋪于6孔板，轉染48 h后吸除培養液，用PBS洗2次，用RIPA裂解液裂解細胞，4℃、12 000 r/min離心5 min，收集上清。用BCA法進行蛋白定量，取50 μg蛋白上樣，12%SDS－PAGE電泳分離轉至硝酸纖維素膜上，10%脫脂奶封閉2 h，加入Ⅰ抗小鼠抗人RRM2抗體 (1∶1 000稀釋)4℃過夜或人HRP標記GAPDH(內參照)抗體 (1∶5 000)1 h，用 PBST洗膜10 min×3次，山羊抗小鼠HRP標記Ⅱ抗 (1∶5 000)于室溫下孵育1 h，用ECL發光，膠片顯色。

2.7 裸鼠皮下移植瘤實驗 乳腺癌細胞MCF－7分3組，分別是轉染siRNA－RRM2組、轉染siRNA－NC組和未處理NEG組。裸鼠也隨機分成相應的3組，每組6只，上述轉染8 h后，按每只5×106個細胞分別皮下接種于這3組BALB/c裸鼠右頸部，繼續飼養，并觀察腫瘤生長情況。按公式V=1/2×a×b2(V:瘤體積;a:長徑;b:短徑)計算腫瘤體積，繪制生長曲線。

3 統計學處理

用SPSS 16.0統計軟件進行分析。數據用均數±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。

結 果

1 RRM2在人乳腺癌細胞系中過表達

Real－time PCR結果顯示MCF－7細胞RRM2 mRNA表達水平約是MCF－10A的2倍，Western blotting結果顯示，MCF－7細胞RRM2蛋白表達顯著高于人正常乳腺上皮細胞MCF－10A的表達，說明RRM2在人乳腺癌細胞MCF－7中相對于人正常乳腺上皮細胞MCF－10A過表達，見圖1。

Figure 1.Expression levels of RRM2 mRNA(A)and protein(B)in MCF－7 and MCF－10A cells.±s.n=5.＊＊P ＜0.05 vs MCF －10A.圖1 人乳腺癌細胞MCF－7和人正常乳腺上皮細胞MCF－10A中RRM2 mRNA與蛋白的表達

2 siRNA－RRM2劑量及時間依賴性地抑制RRM2 mRNA表達

不同濃度的siRNA轉染MCF－7細胞48 h后，siRNA－RRM2組與其它組相比抑制RRM2 mRNA表達的效果隨濃度的增加而增高，具有劑量依賴性，見圖2A。150 nmol/L siRNA －RRM2轉染24、48、96 h后，抑制效果隨時間的增加而增高，具時間依賴性，見圖2B。siRNA－RRM2抑制RRM2 mRNA表達的效果與其它組比較差異均有統計學意義(P＜0.05)。

3 RRM2下調抑制乳腺癌細胞增殖

50 nmol/L、150 nmol/L和300 nmol/L siRNA 轉染細胞48 h后，人乳腺癌細胞MCF－7轉染siRNA－RRM2組與對照組siRNA－NC和空白對照組相比細胞增殖明顯受到抑制，且隨siRNA濃度增加抑制效果更明顯，見圖3A，差異顯著(P＜0.05)。150 nmol/L siRNA轉染細胞24、48和96 h后，人乳腺癌細胞MCF－7轉染siRNA－RRM2組與轉染對照組siRNA－NC和空白對照組相比細胞增殖明顯受到抑制，且隨時間增加抑制效果更明顯，見圖3B，差異顯著 (P＜0.05)。而150 nmol/L siRNA－RRM2轉染人正常乳腺上皮細胞MCF－10A 48 h后對細胞增殖沒有顯著影響，見圖3C。

Figure 2.Knockdown of RRM2 expression in MCF －7 cell line by specific siRNA at different concentrations and different time points.±s.n=5.*P＜0.05 vs other groups.圖2 不同時點、不同濃度siRNA－RRM2轉染對MCF－7 RRM2 mRNA表達的影響

Figure 3.The proliferation of MCF－7 and MCF－10A cells after siRNA－RRM2 transfection at different concentrations and different time points.A:48 h after transfection at different concentrations(MCF －7 cells);B:transfection(150 nmol/L)at different time points(MCF－7 cells);C:48 h after transfection(150 nmol/L，MCF－10A cells).±s.n=5.*P＜0.05 vs other groups.圖3 siRNA下調RRM2基因后MCF－7和MCF－10A細胞的增殖情況

4 siRNA－RRM2抑制MCF－7細胞遷移

150 nmol/L siRNA轉染48 h后，轉染siRNARRM2組與轉染siRNA－NC組相比具有明顯抑制MCF－7細胞遷移的作用 ，見圖4。

Figure 4.Effect of RRM2 silencing on cell migration(crystal violet staining，×200).±s.n=5.*P＜0.05 vs siRNA－NC.圖4 siRNA下調RRM2基因后MCF－7細胞的遷移情況

5 siRNA－RRM2對裸鼠移植瘤生長影響

siRNA－RRM2組中裸鼠腫瘤生長明顯緩慢，體積明顯小于siRNA－NC組和空白組 (P＜0.05)，而siRNA－NC組和空白組裸鼠腫瘤體積之間差異無統計學意義(P ＞0.05)，見圖5。

討 論

本研究首先檢測了RRM2在人正常乳腺上皮細胞MCF－10A和人乳腺癌細胞MCF－7中表達情況，結果顯示RRM2在MCF－7細胞中mRNA及蛋白比在MCF－10A細胞中顯著高表達。RRM2的過表達可使腫瘤細胞的 Raf蛋白表達增加，并使MAPK2和Rac的活性增加，提示RRM2可直接影響腫瘤的生物學行為［10］。依賴c－Myc的RRM2基因擴增顯示基因組的不穩定性且與腫瘤的潛在形成有關［11］，cAMP、Ras和蛋白激酶 C 等信號轉導途徑可調節RRM2的表達，同時這些途徑是腫瘤惡化所必需的，這些研究成果提示下調腫瘤中RRM2的表達是一個潛在的治療策略。

Figure 5.The tumor growth in nude mice after RRM2 silencing.±s.n=5.*P＜0.05 vs siRNA－RRM2 group.圖5 裸鼠接種RRM2基因沉默的MCF－7細胞后腫瘤的生長情況

RRM2與許多癌基因一起協同作用決定細胞轉化和腫瘤形成潛能，Zhou等［12］通過轉染使人口咽腔表皮樣癌細胞的RRM2過度表達，結果使癌細胞的侵襲與轉移能力顯著增強，并在動物模型中發現肺部淋巴結的轉移也明顯增加。Duxbury等［13］采用 RNAi干擾技術抑制胰腺癌細胞中RRM2的表達，可使胰腺癌細胞凋亡并降低癌細胞的侵襲能力，這些研究結果與我們在乳腺癌模型中的研究結果相一致。

RRM2高表達會大大增加腫瘤細胞對化療的抵抗力，會對化療藥物產生耐藥性，因此RR抑制劑類的抗腫瘤藥物是非常具有開發前途的［14］。目前在乳腺癌治療中已經采用針對RRM2 mRNA的反義藥物GTI－2040抑制RR的表達以增強治療效果［15］。本研究發現通過siRNA干擾RRM2的表達，對人正常乳腺上皮細胞MCF－10A體外增殖和遷移沒有影響，但卻可顯著抑制人乳腺癌細胞MCF－7的增殖和其遷移能力，并非常明顯地抑制其在裸鼠體內的成瘤能力。

綜上，抑制RRM2表達對乳腺癌腫瘤治療具有重大意義，而特異沉默RRM2基因可作為一種很好的治療策略。本研究用siRNA干擾技術特異下調RRM2表達，并在體內外顯示了良好的抗腫瘤效果，這些為乳腺癌發生發展分子機制研究提供了參考，并提示RRM2可能是在乳腺癌治療中潛在的有意義的靶點。

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