攜帶中國株HIV－1 gp120 基因的重組腺病毒的構建及其感染巨噬細胞的形態學研究*

王 通， 馬文心， 郭嘉慧， 陳智鵬， 崔毅峙

(暨南大學生命與健康工程研究院，廣東 廣州510632)

我國HIV－1 的流行株主要為B、B'、C 及AE 亞型，其中中國株HIV－1 病毒主要指我國B 亞型流行株，針對其開展病毒學和病理生理學研究有現實意義［1］。

目前研究發現，HIV－1 感染者的癌癥發生風險顯著提高，從而形成了HIV－1 研究領域的一個備受關注的領域，即HIV－1 相關惡性腫瘤(HIV－1－associated malignancies，HAM)問題。HAM 研究主要以隊列研究為主，目的是確證各種癌癥與HIV－1 感染的相關性，而罕見針對HAM 發生機制的研究。

已知HIV－1 可在骨髓中感染造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)，以整合(原病毒)和未整合(胞漿HIV－1 DNA)形式建立潛伏感染，持續慢性復制和釋放子代病毒［2－3］。原病毒在高效抗逆轉錄病毒治療(highly active anti－retroviral therapy，HAART)下不會被根除，仍可在外周血單核細胞中持續，成為組織HIV－1 的來源［4］。例如，在HIV 腦傳播機制中，有“木馬假說”認為，攜HIV DNA 的單核細胞可能跨血腦屏障，在大腦中建立HIV 感染［5］。而未整合HIV－1 DNA 也可能通過類似的木馬機制被單核細胞傳播至組織。這些攜有HIV DNA 的單核細胞將會分化為含HIV DNA 的巨噬細胞，并進而啟動組織炎癥產生應答，從而提供多種刺激細胞增殖的細胞因子，包括IL－6、TNF－α 和IL－1［6］。

這些促增殖細胞因子可能是誘發HAM 的一個主要因素，HIV－1 gp120 蛋白就是這些因子在巨噬細胞內上調的病毒來源激動蛋白之一。因此，本研究首先構建可表達HIV－1 Gp120 蛋白的重組腺病毒，并將HIV－1 gp120 DNA 導入小鼠骨髓來源巨噬細胞(bone marrow－derived macrophages，BMM)，并研究這種含HIV－1 gp120 DNA 的BMM(BMM－gp120)的形態學表型變化特征。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 主要材料 人胚腎轉化細胞293Ad5+細胞系購自中國典型培養物保藏中心(CCTCC);6 ～8 周齡BALB/c 小鼠購自暨南大學實驗動物中心;流式細胞儀FACS Aria 購自BD。腺病毒純化試劑盒購自Biomiga;Millipore 0.22 μm 濾膜購自Syringe;14 kD 透析膜購自聯合碳化物公司。

1.2 主要試劑 pDC316－mCMV－EGFP 和pBHGlox－E1，3Cre 質粒由深圳市百恩維生物科技有限公司提供;中國株HIV－1CNgp120 基因由哈爾濱醫科大學王福祥教授惠贈［7］。LipofectamineTMLTX、PLUSTMReagents、PE 結合的抗鼠CD11b 單克隆抗體、DMEM 培養基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、雙抗和ACK Lysing Buffer 均購自Invitrogen。HIV－1 gp120 ELISA 檢測試劑盒購自上海豐翔生物科技有限公司。M－CSF(macrophage colony－stimulating factor)購自R＆D。極低貼壁6 孔細胞培養板購自Corning。核酸內切酶Nhe I 與Hind III 購自TaKaRa。

2 方法

2.1 重組腺病毒穿梭質粒的構建 本部分由深圳百恩維公司協助完成，以質粒pEGFP－N1－gp120為模板，經PCR 擴增gp120 基因，并克隆至pDC316－mCMV－EGFP 質粒，獲得pDC316－mCMV－EGFP－gp120 穿梭質粒。用小量質粒抽提試劑盒抽提質粒，并分別用Nhe I 與Hind III 進行酶切鑒定。

2.2 重組腺病毒的包裝與擴增 將293Ad5+細胞以5 ×105cells /well 接種于6 孔板中。用含10%FBS 的DMEM 培養基(無抗生素)，并置37 ℃、5%CO2的溫度濕度培養箱中培養24 h。每孔加pBHGlox－E1，3Cre 質粒4 μL、pDC316－mCMV－EGFP或pDC316－mCMV－EGFP－gp120 穿梭質粒1 μL，以及Lipofectamine 10 μL。繼續培養24 h，在倒置熒光顯微鏡下觀察發綠熒光細胞比例，確定轉染效率。繼而每24 h 觀察1 次并記錄細胞形態變化。待板孔內細胞長滿后，將所有細胞及培養基轉入T25 培養瓶繼續培養，再度長滿后續轉T75 瓶。總計約10 d后，可見細胞出現葡萄狀聚團即細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)，此時輕柔吹落細胞并收集，再用1 mL PBS 重懸細胞，并將細胞反復置于－80 ℃及37 ℃凍融3 次。離心收取凍融液，為第1 代病毒。將293Ad5+細胞接種于T75 瓶中，待其長至80% 匯合度(confluence)，加入500 μL 第1 代病毒，并用含抗生素、5% FBS 的DMEM 培養基繼續培養細胞，直至細胞出現CPE 現象時，收集培養基及細胞凍溶液以獲得第2 代病毒。

2.3 重組腺病毒的純化 該方法的原理是以病毒特異性親和柱捕獲重組腺病毒，進而洗脫病毒達到純化目的。具體操作為取15 mL 離心管，棄蓋，將病毒純化柱裝入，300 ×g 離心2 min。掰斷純化柱下蓋，讓原浸柱液流出。后加入2 mL 超純水，及5 mL 1 × wash buffer。將含第2 代病毒的培養基和細胞凍融液以0.22 μm 濾膜過濾除雜后上樣。待樣品液過柱后，加入2 ～3 mL 1 × elution buffer，將被柱吸附的病毒洗脫。收集洗脫液裝入14 kD 孔徑透析袋，以D－PBS 為透析液，4 ℃過夜透析病毒樣品。透析最長時間≤18 h。待樣品脫色至透明后，收集樣品。再次以0.22 μm 濾膜過濾除雜。得到工作病毒，以－80 ℃凍存。

2.4 重組腺病毒ELISA 鑒定 設標準曲線梯度為1 ×10－7mg/L、5 ×10－8mg/L、2.5 ×10－8mg/L 和0 mg/L，以DMEM 培養基及PBS 為對照。樣品稀釋5倍加入，每個樣品做3 個復孔，分別為Ad－HIV－1 gp120 感染細胞的培養基上清(Ad－gp120 supernatant)和細胞裂解液(Ad－gp120 cell lysate);Ad－GFP 感染細胞的培養基上清(Ad－GFP supernatant)和細胞裂解液(Ad－GFP cell lysate)。加樣后封板4 ℃過夜，洗板，每孔加入酶標試劑(結合辣根過氧化物酶的抗gp120 抗體)50 μL，37 ℃溫育30 min。再次洗板，加顯色液避光15 min。終止顯色后以450 nm 波長測吸光度值。

2.5 重組腺病毒TCID50滴度測定 將生長狀況良好的293Ad5+細胞以每孔1 ×104接種于96 孔板中，每孔培養體積為100 μL，培養24 h 后，每孔分別加入100 μL 不同稀釋度的重組病毒液(包括:10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9、10－10和10－11)。培養3 d 后，熒光顯微鏡下進行熒光計數。按照Karber 公式［8］，病毒滴度為T =10L－d(s－0.5)，L =log10(最高稀釋度)，d = log10(稀釋度差值)= 1，s = 陽性比率之和，計算病毒效價。

2.6 重組腺病毒滴度感染復數(multiplicity of infection，MOI)復驗 擇6 ～8 周齡小鼠，頸椎脫臼法處死后酒精消毒，生物安全柜內解剖，取其完整股骨及脛骨，除凈肌肉，去骨兩端，用DMEM 沖出骨髓，250 ×g離心5 min 收集沉淀，以適當比例ACK 裂解紅細胞雜質，過70 μm 濾膜收集骨髓單細胞懸液。將細胞按1×106cells/well，接種于極低貼壁6 孔板內。加入含10 μg/L M－CSF 及10% FBS 的DMEM 分化培養基培養6 d，得到分化成熟的BMM。向每孔BMM 細胞分別加入不同濃度的P1 代Ad－GFP 及Ad－gp120病毒各100 μL(設置MOI 梯度為0.1、1 和10)。48 h 后，將各孔細胞分別收集入EP 管，PBS 洗1 次，以100 μL PBS 重懸細胞，按每1 ×106cells /well 對應0.3 μL CD11b－PE 之比例加入CD11b－PE 抗體混勻，避光靜置30 min 后用流式細胞儀檢測，CD11b 陽性細胞為BMM，GFP 陽性細胞為感染細胞。細胞形態學改變用熒光顯微鏡觀察。

3 統計學處理

流式細胞術結果利用FlowJo 7. 6. 5 軟件分析(TreeStar)。統計數據利用GraphPad Prism 5.0.2 軟件分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用Student's t 檢驗，數據以均數±標準差(±s)表示，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 成功獲得重組腺病毒質粒

用Nhe I 與Hind III 對pDC316－mCMV－EGFP－gp120 質粒做酶切鑒定后在電泳凝膠的約4.5 kb位置出現DNA 條帶，分子量與gp120 基因相符。經測序表明，穿梭質粒所攜帶gp120 確為中國株HIVCN基因［7］。

2 成功構建重組腺病毒

由于AdMax 系統所用骨架質粒為缺陷病毒基因組，故此病毒僅能借助特殊細胞系293Ad5+的細胞基因組Ad5+區互補完善自身，并跟隨細胞復制而自行復制。感染后培養48 h，光鏡觀察可見貼壁細胞出現漂浮、團聚，并呈葡萄狀等典型的CPE 現象，見圖1A、B;其熒光視野可見GFP 熒光。根據AdMax系統工作原理，當細胞可表達GFP 時可證明穿梭質粒和骨架質粒已經通過Cre/LoxP 重組整合，表明腺病毒胞內組裝成功，即攜中國株HIV－1 gp120 基因的重組腺病毒(Ad－gp120)及其對照空載病毒(Ad－GFP)構建成功，見圖1。為了最大程度上減少變異，本研究所有感染實驗所用重組腺病毒均為1 ～3代病毒。

Figure 1. The cytopathic effects of recombinant adenoviruses on infected 293Ad5 + cells.Scale bar = 20 μm.圖1 重組腺病毒感染293Ad5 +細胞的細胞病變效應觀察

3 HIV－1 gp120 蛋白表達

由于AdMax 系統的目的基因和GFP 為分別表達，因此，我們采用ELISA 技術對HIV－1 gp120 蛋白表達進行確證性研究。作為陰性對照，培養基和PBS 對照的吸光度值平均值，以及樣品標準曲線的Y軸節距均在0.31 左右，因此我們將本ELISA 檢測低限(lower limit of detection，LLD)設置在0.31，見圖2。該LLD 高于對照組(Ad－GFP)感染的細胞裂解液和上清以及Ad－gp120 感染的細胞培養上清的吸光度值。據此，僅有Ad－gp120 細胞裂解所得上清(Ad－gp120 cell lysate)的吸光度值顯著高于其它各組，見圖2，其為gp120 蛋白陽性，且蛋白濃度均值為4.1 ×10－8mg/L。這表明Ad－gp120 在293Ad5+細胞內表達了gp120 蛋白。

4 重組腺病毒滴度測試及MOI 復驗

按照Karber 法計算，Ad－gp120 病毒滴度為108.3TCID50/mL;Ad－GFP 病毒滴度為108.1TCID50/mL。以此滴度為依據設定MOI 梯度感染BMM，流式結果符合TCID50法計算所得結果，見圖3。巨噬細胞本身不含GFP，故可依據綠熒光的比率判斷病毒的感染效率。在MOI = 0.1 時，33.2%的細胞為GFP陽性，而當MOI = 1 和10 的時候，該比率上升到84.7%和84.9%。在MOI 相差10 倍時熒光比率沒有更大變化，可證明MOI=1 時已基本達到最大感染率，見圖3。其中，BMM 的純度由CD11b+細胞所占比率反映，從圖3 可見，各組CD11+BMM 所占比率均高于93%。

5 Ad－gp120 感染的巨噬細胞的表型改變

Figure 2. Expression of HIV－1 gp120 in 293Ad5 + cells.LLD:lower limit of detection，which is 0.31. ±s. n =3.＊＊P ＜0.01 vs other groups.圖2 gp120 蛋白在293Ad5 +細胞中的表達

Figure 3. Capacity of Ad－gp120 of infecting BMM at different MOI (from left to right:control，MOI=0.1，MOI=1，MOI=10).圖3 流式細胞術檢測不同MOI 梯度的Ad－gp120 感染BMM 的能力

在MOI 等于1 時，不同重組腺病毒感染BMM 出現了顯著的形態差別，見圖4。BMM 在Ad－GFP 感染下，呈貼壁生長，并主要為梭形和圓形，見圖4A、B。而在Ad－gp120 感染后，表現為包括拉長、偽足形成、分枝和不規則形變等，見圖4C、D。尤其是，Ad－gp120 感染的BMM 的細胞形狀指數(shape index=細胞長度/細胞平均寬度)顯著高于Ad－GFP 細胞［P ＜0. 05，n = 10，即從高倍視野(high power fields，HPF)中隨機選取10 個細胞］，見圖4E。這表明，Ad－gp120 感染可介導BMM 形態改變。

討 論

HIV－1 gp120 由env 基因所編碼，是HIV 的包膜蛋白，為HIV 主要毒性因子之一，可特異性識別和結合CD4 和CCR5/CXCR4 等細胞表面受體，介導病毒與細胞膜融合進入細胞;或可橋聯含HIV 細胞與正常細胞的融合以介導病毒感染正常細胞［9］。gp120 可通過內源和外源途徑促進單核巨噬細胞分泌巨噬細胞炎癥蛋白1α(macrophage inflammatory protein 1α，MIP－1α)、MIP－1β、受激活調節正常T細胞表達和分泌因子(regulated upon activation，normal T cell expressed and secreted，RANTES)、IL－1β、TNF－α、IL－10 等細胞因子，同時還包括全部3 種絲裂原激活蛋白激酶，即ERK、p38 和JNK［6］。這些炎癥應答產物均與腫瘤細胞的增殖、遷移和分化等有密切關系。

HIV DNA 在巨噬細胞內不整合即降解［10］。但目前研究發現，未整合的HIV DNA 在巨噬細胞中至少可持續30 d，期間HIV－1 env(包括gp120 和gp41)、nef 和tat 等病毒基因持續轉錄，而rev 和vif幾乎不轉錄，體現了潛伏感染的特征［11］。本研究所提供的BMM－gp120 細胞正是HAM 周圍含HIV－1 DNA 巨噬細胞的理想模型，從而有利于進一步開展HAM 的機制研究。

腺病毒的滴定方法通常為紫外分光光度法測VP 值，但此法不能排除包裝缺陷病毒或無感染能力病毒顆粒［12－13］。故本實驗采用并改進了可檢活病毒感染力的TCID50滴度測試法［14］。傳統TCID50測定需通過觀察細胞CPE 有無判斷陽性與否，故一般需10 d 左右知道結果。而本實驗中的病毒可表達GFP，故我們觀察到有綠熒光孔基本可判斷為陽性孔。本研究表明，滴毒后24 h 可見綠熒光，滴毒3 d后則可確定陽性孔數量，且由于此時陽性孔內熒光點數基本 ＞3 處，假陽性孔也可以被區分。

Figure 4. Morphological changes of recombinant adenovirus－infected BMM. ±s.n=10. * P ＜0.05 vs Ad－GFP.圖4 重組腺病毒感染BMM 的形態學改變

近年來，流式細胞術因其檢測快捷，結果直觀等優點，在檢測病毒感染方面得到了廣泛運用，但也有諸多論文指出其誤差率較大［15］。故本實驗同時采用傳統TCID50滴度測試和流式細胞術檢測MOI 法，相互印證以保證病毒滴度結果的可信度。

AdMax 系統構建重組腺病毒有較多優點，包括同源重組效率較高、從質粒構建到重組出毒時間短，且在293Ad5+中，其轉染成功率大于98%。另外，有報道指出該系統出毒后，95%的病毒子含目的基因，故非常有利于目的基因的功能研究［16］。

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