Trx－ASK1 在多柔比星誘導的乳鼠心肌細胞凋亡中的作用

黃海高， 李悅山

(廣州醫學院藥理教研室，廣東 廣州510182)

硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)是廣泛存在于生物體內的一種多功能小分子蛋白，因其具有重要的抗氧化和抗凋亡作用［1］而備受研究者重視。研究發現Trx 的抗凋亡作用主要通過抑制凋亡信號調節激酶1(apoptosis signal－regulating kinase 1，ASK1)，進而抑制了ASK1 所介導的凋亡下游信號通路［2］。

多柔比星(doxorubicin，DOX)是一種蒽環類抗生素，臨床上廣泛應用于各種腫瘤的治療［3］，但是其應用過程中會出現很強的心臟毒性［4］，進而導致各種心肌病與心力衰竭的發生［5－6］。研究表明DOX 的心臟毒性與心肌細胞的凋亡密切相關，但是目前有關凋亡的具體機制仍然不是十分明確。DOX 體外誘導心肌細胞凋亡過程中Trx－ASK1 是否會發生分離以及ASK1 是否會被活化進而啟動凋亡下游信號通路，目前未見相關報道。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 主要試劑 DOX、ebselen 和細胞級二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購于Sigma。高糖DMEM培養基、胎牛血清和胰蛋白酶購自Gibco。MTT、細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、caspase－3 分光光度法檢測試劑盒和細胞凋亡熒光Hoechst 33258 試劑盒購于南京凱基生物。熒光探針熒光素2'，7'－二氯二氫熒光素二乙酯(2'，7'－dichlorodihydrofluorescin diacetate，H2DCFDA)購于Molecular Probes。免疫沉淀試劑盒、BCA 蛋白測定試劑盒和發光液購自Pierce。兔Trx 多克隆抗體購于Millipore;山羊ASK1多克隆抗體購于Santa Cruz;聚ADP 核糖聚合酶1［poly(ADP－ribose)polymerase 1，PARP 1］、磷酸化ASK1(p－ASK1)、p38 有絲分裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen－activated protein kinase，p38)和磷酸化p38(p－p38)抗體購于Cell Signaling Technology。1.2 動物 SPF 級Sprague－Dawley 新生大鼠(1 ～3 d)，雌雄不限，由廣州中醫藥大學動物中心提供。

2 方法

2.1 心肌細胞培養 乳鼠心肌細胞原代培養參照Simpson 等［7］的方法改進而得。取新生24 ～72 h 的SD 乳鼠消毒后，在超凈臺無菌操作下快速打開乳鼠胸腔暴露心臟，取左室心肌組織立即浸入冰冷的D－Hanks 液中，重復，直到剪完所有乳鼠，用D－Hanks 液沖洗，剪成(0.5 ～1)mm ×1 mm ×1 mm 大小的組織塊，再沖洗數次;將心肌組織碎塊轉移至無菌錐形瓶，加消化液(0.125%胰蛋白酶液)6 ～8 mL，37 ℃恒溫磁力攪拌50 r/min。用0.125%胰蛋白酶消化8 次左右，每次6 ～8 min，吸管輕輕吸取上清，移入冷的離心管中，收集除前2 次以外的消化液，(每次消化后，用吸管吹打30 s，靜置約2 min)用適量含血清的冰培養基終止消化，1 000 r/min 離心10 min，棄上清，收集所有沉淀加入含15% FBS 的DMEM 培養基重懸細胞，將細胞懸液培養于培養皿中，置37℃、5% CO2水套式培養箱中培養2 h。因內皮細胞和成纖維細胞較心肌細胞容易貼壁生長，2 h 后培養液中懸浮的細胞95%是心肌細胞。小心吸出細胞懸浮液計數，根據需要稀釋到一定密度(5 ×105～1 ×106)，接種于培養皿或孔板中。24 h 后換液，換為無血清加胰島素(10 mg/L)、轉鐵蛋白(10 mg/L)、維生 素B12(1.5 μmol/L)和BrdU (0.1 mmol/L)的DMEM 培養基。第3 d 換液，換用不含BrdU 的上述無血清培養基。如果可見細胞搏動率大于95%，即可進行以下實驗。

2.2 心肌細胞活力測定 參照南京凱基生物的MTT 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒說明書，通過酶標儀檢測吸光度值，考察心肌細胞的活力。

2.3 細胞漿caspase－3 活性的測定 參照凱基生物的caspase－3 分光光度法檢測試劑盒說明書，通過酶標儀檢測吸光度值，考察caspase－3 的活化程度。

2.4 心肌細胞凋亡熒光顯微鏡觀察 參照南京凱基生物的細胞凋亡熒光Hoechst 33258 試劑盒說明書，正常細胞顯淡藍色，凋亡細胞細胞核濃縮，顯亮藍色。

2.5 DOX 誘導心肌細胞內活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產生 預孵育50 μmol/L ebselen 2 h，給予1 μmol/L DOX。24 h 后，用ROS 敏感的熒光探針H2DCFDA 標記細胞，熒光顯微鏡下檢測細胞內H2DCFDA 熒光強度變化，以熒光強度反映細胞內ROS 含量的變化。

2.6 免疫沉淀試劑盒檢測Trx－ASK1 的分離 用多克隆ASK1 抗體和免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)方法獲取細胞中的總ASK1。具體方法參照Pierce 公司的IP 試劑盒說明書。Trx－ASK1 的分離使用抗Trx 多克隆抗體檢測。

2.7 Western blotting 檢測cleaved PARP1、p－ASK1(Ser967)、p38 和p－p38 蛋白水平 提取細胞總蛋白后，BCA 法測定蛋白濃度。電泳，轉膜，脫脂奶粉封閉，孵育Ⅰ抗(1 ∶1 000)4 ℃過夜，或β－actin(1∶1 000)室溫孵育2 h，Ⅱ抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，曝光。結果用圖像分析系統進行分析。

3 統計學處理

用SPSS 16.0 統計軟件進行分析。數據用均數±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD 法)。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 不同濃度DOX 作用后細胞活力檢測

待心肌細胞搏動率大于95%，換用不含Brdu 的上述無血清培養基，分別給予0、0.1、0.5、1 和5 μmol/L DOX。24 h 后，檢測細胞活力。1 μmol/L 與5 μmol/L DOX 組MTT 值下降，與對照組MTT 值比較均有顯著差異(P ＜0.01)，見圖1A。

Figure 1. Effects of doxorubicin (DOX)on vability (A，n =6)and apoptosis［caspase－3 activation (B，n =4)and PARP1 cleavage (C，n=3)］of cardiomyocytes. ±s. △△P ＜0.01 vs 0 μmol/L.圖1 不同濃度DOX 對心肌細胞活力和凋亡的影響

2 不同濃度DOX 作用后細胞漿caspase－3 活性的測定

心肌細胞分別給予0、0.1、0.5、1 和5 μmol/L DOX，24 h 后檢測胞漿caspase－3 活性。與對照組相比，1 μmol/L DOX 組caspase－3 活 化度為(151.23 ±10.41)% (P ＜0.01)，5 μmol/L DOX 組caspase－3 活 化 度 為(161.03 ± 12.21)% (P ＜0.01)，見圖1B。

3 不同濃度DOX 作用后細胞cleaved PARP1 的檢測

心肌細胞分別給予0、0.1、0.5、1 和5 μmol/L DOX，24 h 后檢測cleaved PARP1 的表達。與對照組相比，1 μmol/L 和5 μmol/L DOX 組cleaved PARP1表達明顯增加(P ＜0.01)，見圖1C。

4 預孵育ebselen 后細胞活力檢測

待心肌細胞搏動率大于95%，換用不含BrdU 的上述無血清培養基，預孵育50 μmol/L ebselen 2 h，給予1 μmol/L DOX。24 h 后，檢測細胞活力。1 μmol/L DOX 組MTT 值下降，與對照組MTT 值比較有顯著差異(P ＜0.01);ebselen 可以顯著抑制DOX對細胞的損傷，與DOX 組MTT 值比較有顯著差異(P ＜0.05)，見圖2A。

Figure 2. Ebselen (Ebs)reduced DOX－induced cardiomyocyte apoptosis. ±s. A:n =6;B:n =4;C:n =3. △△P ＜0.01 vs control;* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs DOX.圖2 Ebselen 抑制多柔比星誘導的心肌細胞凋亡

5 預孵育ebselen 后細胞漿caspase－3 活性的測定

預孵育50 μmol/L ebselen 2 h，給予1 μmol/L DOX。24 h 后，檢測胞漿caspase－3 活性。與對照組相比，1 μmol/L DOX 組caspase－3 活化度為(171.04 ±10.41)% (P ＜0.01);與DOX 組相比，ebselen 可以顯著抑制caspase－3 的活化［(125.04 ±6.41)%］(P ＜0.05)，見圖2B。

6 預孵育ebselen 后細胞cleaved PARP1 的檢測

預孵育50 μmol/L ebselen 2 h，給予1 μmol/L DOX。24 h 后，檢測cleaved PARP1 的表達。與對照組相比，1 μmol/L DOX 組cleaved PARP1 表達明顯增加(P ＜0.01);與DOX 組相比，ebselen 組cleaved PARP－1 表達明顯減少(P ＜0.01)，見圖2C。

7 DOX 和(或)ebselen 對心肌細胞內ROS 產生的影響

預孵育50 μmol/L ebselen 2 h，給予1 μmol/L DOX。24 h 后，加入熒光探針H2DCFDA 孵育30 min清洗后觀察，DOX 組比對照組細胞內單位面積熒光強度顯著增強，證實有ROS 的產生，給予ebselen 后，ROS 量減少，見圖3。

Figure 3. Ebselen (50 μmol/L for 24 h)inhibited DOX(1 μmol/L)－ induced ROS production in cardiomyocytes. A:control;B:DOX;C:DOX+ebselen;D:ebselen..圖3 Ebselen 抑制DOX 誘導的心肌細胞內ROS 的產生

8 細胞凋亡熒光顯微鏡觀察

預孵育50 μmol/L ebselen 2 h，給予1 μmol/L DOX。24 h 后，Hoechst 33258 熒光染色。對照組細胞呈淡藍色，1 μmol/L DOX 組細胞呈亮藍色，有明顯的核固縮，具有凋亡的顯著特征，與DOX 組相比，ebselen 組凋亡有所改善，見圖4。

Figure 4. Ebselen (50 μmol/L for 24 h)inhibited DOX(1 μmol/L)－induced apoptosis of cardiomyocytes (Hoechst 33258 staining，×400). A:control;B:DOX;C:DOX+ebselen;D:ebselen.圖4 Ebselen 抑制DOX 誘導的心肌細胞凋亡的形態學觀察

9 免疫沉淀檢測Trx－ASK1 的分離

預孵育50 μmol/L ebselen 2 h，給予1 μmol/L DOX。24 h 后，檢測Trx－ASK1 的分離，與對照組相比，1 μmol/L DOX 組Trx－ASK1 的分離顯著增加(P＜0.01)，與DOX 組相比，ebselen 組Trx－ASK1 分離減少(P ＜0.01)，充分說明DOX 作用心肌細胞后，Trx－ASK1 發生了分離(P ＜0.01)，給予ebselen 后，分離有所減少(P ＜0.01)，見圖5。

Figure 5. Effect of ebselen (50 μmol/L for 24 h)on DOX(1 μmol/L)－induced Trx－ASK1 dissociation in cardiomyocytes measured by immunoprecipitation. ± s. n=3. ##P ＜0.01 vs control;△△P ＜0.01 vs DOX.圖5 免疫沉淀法檢測ebselen 對DOX 誘導的心肌細胞Trx－ASK1 分離的影響

10 p－ASK1(Ser967)、p38 和p－p38 蛋白表達檢測

預孵育50 μmol/L ebselen 2 h，給予1 μmol/L DOX。24 h 后，檢測p－ASK1(Ser967)的表達，與對照組相比，1 μmol/L DOX 組p－ASK1(Ser967)表達顯著減少(P ＜0.01)，與DOX 組相比，ebselen 組p－ASK1(Ser967)表達顯著增加(P ＜0.01)，見圖6;同樣預孵育50 μmol/L ebselen 2 h，DOX 處理后15 min檢測p38 和p－p38 的表達，與對照組相比，1 μmol/L DOX 組p－p38 顯著增加(P ＜0.01)，與DOX 組相比，ebselen 組p－p38 顯著增加(P ＜0.01);各組之間p38 的表達無顯著差異，見圖7。說明DOX 作用心肌細胞后，ASK1 和p38 均被激活。

Figure 6. Effect of ebselen (50 μmol/L for 24 h)on DOX(1 μmol/L)－induced expression of p－ASK1 in cardiomyocytes. ±s. n=3. △△P ＜0.01 vs control;* P ＜0.05 vs DOX.圖6 Ebselen 對DOX 作用的乳鼠心肌細胞p－ASK1 表達的影響

Figure 7. Effect of ebselen (50 μmol/L for 24 h)on DOX(1 μmol/L)－induced expression of p38 and p－p38 in cardiomyocytes. ± s. n =3. ##P ＜0.01 vs control;△△P ＜0.01 vs DOX.圖7 Ebselen 對DOX 作用的乳鼠心肌細胞p38 和p－p38表達的影響

討 論

本實驗應用DOX 體外誘導乳鼠心肌細胞凋亡，首次證明了在此凋亡過程中Trx 和ASK1 發生了一定程度的分離，進而啟動了ASK1 介導的凋亡信號通路，這可能成為DOX 誘導心肌細胞凋亡的機制之一。

DOX 是一種臨床上廣泛應用于抗腫瘤的藥物，但由于具有很強的心臟毒性，應用受到了很大的限制。研究發現，心肌細胞的凋亡是DOX 心臟毒性最為直接的表現形式之一［8］。關于DOX 導致的心肌細胞凋亡的具體機制目前研究并不是十分充分。

眾多研究表明，DOX 作用心肌細胞后，細胞內會產生較多的ROS，進而認為ROS 在細胞凋亡過程中起到了重要的作用［9－10］。文獻報道DOX 誘導心肌細胞凋亡時1 μmol/L 的濃度被認為是與臨床應用最為相關的濃度。因此本實驗選取了DOX 0.1、0.5、1 和5 μmol/L 濃度觀察DOX 對心肌細胞存活率的影響(MTT 檢測)，及對caspase－3 和PARP1 活化的影響。基于大量實驗研究報道DOX 誘導細胞凋亡過程中細胞內ROS 含量會增加，我們選取了抗氧化劑ebselen 作為保護劑。實驗證實DOX 作用于心肌細胞可以發生明顯的凋亡，并且細胞內的ROS量顯著增加，caspase－3 活化，PARP1 蛋白發生活化，給予抗氧化劑ebselen 后得到了顯著改善。

硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)是幾乎存在于所有原核和真核生物內的一種多功能小分子蛋白，同時也是細胞內重要的二硫鍵還原酶，對維持細胞內蛋白質的還原狀態并正常發揮功能起著非常重要的作用。生物體內的Trx 系統包括Trx、Trx 還原酶(TrxR)、還原型輔酶II(NADPH)和Trx 過氧化物酶(TrxP)。這是一個控制細胞還原/氧化狀態和細胞增殖/生存的廣泛表達的氧化還原酶系統。Trx－1除了具有抗氧化作用外，還具有抗凋亡作用［1－2］。其抗凋亡作用與細胞內的ASK1 密切相關。ASK1 是一種有絲分裂原激活蛋白激酶激酶激酶家族(MAPKKK)中的一員，在凋亡信號中發揮著重要作用。ASK1 活化可以激活有絲分裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)家族中的MAPKK4、MAPKK7 和MAPKK3、MAPKK6，進而活化有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中c－Jun 氨基端激酶(JNK)和p38(p38 MAPK)這兩個促凋亡蛋白激酶。促凋亡蛋白激酶p38 與JNK 的活化會通過caspase 依賴途徑激活caspase－3，進而激活PARP1 蛋白，PARP1 活化則失去重要的DNA 修復功能，最終導致細胞凋亡。還原型Trx－1 主要是通過Cys－32、35 的巰基與ASK1的N 端連接，從而抑制了ASK1 介導的細胞凋亡［2］。前面實驗我們已經證實給予1 μmol/L DOX 后細胞內ROS 含量顯著增加，由此我們推測在這一過程中Trx 發生了氧化，與ASK1 發生了分離。為了證實我們的假設，我們采用免疫沉淀法分別檢測了正常組、DOX 組、ebselen + DOX 組和單純ebselen 組細胞內Trx－ASK1 是否發生分離，結果發現與正常組細胞比較，DOX 組細胞內Trx－ASK1 發生了顯著的分離(P ＜0.01)，較DOX 組，ebselen +DOX 組細胞內Trx－ASK1 分離減少(P ＜0.01)。免疫沉淀證實了給予DOX 后細胞內Trx－ASK1 發生了分離，接著我們檢測了ASK1 是否發生活化。我們選用p－ASK1(Ser967)抗體進行Western blotting 檢測。p－ASK1(Ser83)、p－ASK1(Ser967)發生去磷酸化或者p－ASK1(Thr845)發生磷酸化均可代表ASK1 的活化。本實驗發現，與正常組細胞比較，DOX 組細胞內p－ASK1(Ser967)表達顯著減少(P ＜0.01)，較DOX組，ebselen+DOX 組細胞內p－ASK1(Ser967)表達顯著增加(P ＜0.01)。這可以說明給予DOX 后，ASK1 發生了活化，給予ebselen 后活化減少。我們發現與正常組細胞比較，DOX 組細胞內p－p38 表達顯著增加(P ＜0.01)，較DOX 組，ebselen +DOX組細胞內p－p38 表達顯著減少(P ＜0.01)。這說明，給予DOX 后，細胞內p38 發生了活化，給予ebselen 后，活化減少。由此說明，DOX 體外誘導的心肌細胞凋亡過程中Trx－ASK1 發生了一定程度的分離，ASK1、p38、caspase－3 和PARP1 均參與了這一凋亡過程。

DOX 作用心肌細胞后細胞內硝基酪氨酸量顯著增加，過多亞硝酸鹽的產生可以使一些凋亡相關蛋白發生硝基化進而導致凋亡的發生［11］。DOX 作用心肌細胞可以抑制一些特定基因的表達［12－13］。本文主要是探討在氧化應激的情況下Trx－ASK1 這一復合體的變化，以及下游相關蛋白的變化。對于在這一過程中凋亡信號通路中其它蛋白的變化情況以及是否還存在其它凋亡機制，我們將在后續工作中進一步探討。

綜上所述，本實驗初步證實DOX 誘導心肌細胞凋亡過程中，Trx－ASK1 發揮了一定的作用，這將有助于進一步了解DOX 心臟毒性的機制。

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