原子力顯微鏡觀察青蒿琥酯對人胃癌細胞株SGC－7901 膜表面形貌的影響*

柳佳利， 王 珣， 楊亞萍， 梁志紅， 孫 浩， 林 熙， 張 洋

(暨南大學1醫學院臨床醫學專業，2分析測試中心，3醫學院醫學藥理學系，廣東 廣州510632;4廣東省人民醫院病理醫學部檢驗科，廣東 廣州510080)

細胞膜是由磷脂雙分子層和鑲嵌、貫穿在其中及吸附在其表面的蛋白質組成。它不單是細胞的物理屏障，而且在細胞的生命活動中還發揮著細胞間信號的檢測與傳遞、物質運輸、能量轉換、細胞表面識別和細胞分化等許多復雜的功能。由于細胞外部化學信號無論是作用于細胞核的信號，還是作用于核外的信號，它們的傳遞都必須經由細胞膜，與細胞膜表面的受體結合，或經膜表面的特殊部位，如膜通道，進入到細胞內發揮作用。因此研究細胞膜的形態和功能對認識膜分子的信號轉導，蛋白質分選及膜微結構域的生理功能有重要的意義。

原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)自20 世紀80 年代問世以來，已經廣泛應用于生物醫學領域［1］。AFM 通過探測探針與被測樣品之間微弱的相互作用力(范德華力)來獲取樣品表面形貌的信息，與傳統的光學顯微鏡和電鏡相比，AFM 具有制作標本簡單、觀察環境廣泛、高分辨率的2D 和3D 形貌圖像［2］，以及在分子水平上進行力譜曲線的檢測，獲得細胞機械性能的相關物理參數［3］等諸多優點。AFM 被廣泛應用于紅細胞、淋巴細胞、細菌等成像研究［4-6］，使AFM 成為觀察和鑒別某些細胞的有力工具;同時近些年來，AFM 亦用于腫瘤細胞的成像研究，可作為檢測腫瘤細胞的凋亡以及評估抗腫瘤藥物療效的工具［7］。青蒿琥酯(artesunate，ART)是中藥青蒿提取物青蒿素的衍生物，已證實青蒿素及其衍生物具有抗瘧疾、抗腫瘤、免疫調節等多種重要藥理作用，其中抗腫瘤作用日益受到重視［8］。如Yamachika 等［9］提出青蒿素通過誘導細胞的凋亡而殺傷腫瘤細胞;Cai 等［7，10］應用AFM 觀察了青蒿素誘導Jurkat 細胞株(急性T 細胞白血病細胞系)凋亡，促使Jurkat 細胞膜的損傷的作用。盡管目前國內外對青蒿素抗腫瘤的作用有不少的報道，但利用AFM 觀察青蒿素對腫瘤細胞膜(尤其是對實體瘤的細胞膜)形貌影響的相關報道仍比較少。本文以人胃癌細胞株SGC -7901 為研究對象，通過作用不同濃度的ART，采用原子力顯微鏡來觀察藥物對細胞表面形貌和超微結構的影響，并結合流式細胞術和激光共聚焦顯微鏡觀察細胞凋亡的情況。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和儀器

人胃癌細胞株SGC -7901(中山大學中山醫學院);青蒿琥酯注射用滅菌粉末(廣西桂林制藥廠);RPM I -1640 培養基及胰酶(Gibco);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司);Annexin V -FITC 試劑盒(南京凱基生物技術發展有限公司);DAPI 熒光探針(Sigma)。倒置顯微鏡(Olympus);BIOSCOPE Catalyst Scanasyst 型原子力顯微鏡(Bruker);FACS Aria 型流式細胞儀(BD);LSM 510 型激光共聚焦顯微鏡(Karl Zeiss)。

2 方法

2.1 細胞培養 將人胃癌細胞株SGC -7901 接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基中，置5%CO2、37 ℃的孵箱中常規培養，細胞貼壁生長，每2 ～3 d 換液1 次，當細胞生長匯合時，按1∶3 傳代，每周傳代1 ～2 次。用0.25%胰蛋白酶+0.02% 乙二胺四乙酸消化，收集對數生長期細胞進行實驗。

2.2 AFM 樣品制備 取對數生長期細胞，用完全培養液調整細胞濃度為1 ×109cells/L，接種于6 孔培養板中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h 后加入不同濃度(2.5 μmol/L、5 μmol/L 和10 μmol/L)青蒿琥酯。藥物作用24 h后用PBS 洗滌并重懸，滴于玻片上，使其自然鋪展，吸附10 min。然后用pH 7.4的PBS 緩沖液沖洗，用1%戊二醛溶液固定15 min，用蒸餾水沖洗3 次，室溫自然干燥后上機觀察。

2.3 AFM 樣品成像 將制備好的樣品置于Nano-Scope AFM 載物臺上，利用Olympus 倒置顯微鏡觀察細胞的分散情況，在大氣中應用AFM 對樣品進行掃描成像。在操作軟件中選擇 Scanasyst 模式，Scanasyst-Air 型探針，微懸臂彈性系數為0.4 N/m。AFM 圖像經過自帶軟件(Nanoscope Analysis)平滑處理，以消除掃描方向上的低頻背景噪音。通過測量細胞核高度反映經藥物作用后細胞核是否發生坍塌、腫脹等變化，利用軟件測量納米級表面粗糙度來觀察膜表面的粗糙程度，反映細胞表面超微結構的變化。

2.4 流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況 采用Annexin V - FITC 和PI 雙染法對凋亡細胞進行檢測。具體操作如下:收集對數生長期的SGC -7901細胞，常規消化后，接種于6 孔板，每孔加細胞液1 mL，待24 h 細胞完全貼壁后，加入青蒿琥酯干預24 h，然后用胰酶消化，在Buffer 液體中重懸，調整細胞濃度為1 ×109cells/L，加FITC 結合的Annexin V和PI 孵育15 min，上流式細胞儀測定凋亡細胞所占比例。流式細胞儀激發光波長采用488 nm，檢測光波長采用525 ～550 nm 的綠色FITC 熒光和 ＞575 nm 的紅色PI 熒光。活細胞僅有很低的熒光強度，早期凋亡細胞有較強的綠色熒光，晚期凋亡細胞有綠色和紅色熒光雙重染色。每樣本收集1 ×105個細胞熒光信號，Cellquest 軟件分析結果，細胞凋亡率(%)=(早期凋亡細胞數+晚期凋亡細胞數)÷ 細胞總數×100%。

2.5 DAPI 染色檢測細胞凋亡 取對數生長期細胞，用完全培養液調整細胞濃度為1 ×109cells/L，接種于6 孔培養板中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h 后，加入青蒿琥酯干預24 h，然后用PBS 洗滌并重懸，加入濃度為1 μmol·L-1DAPI 熒光染料，室溫避光反應15 min，于激光共聚焦顯微鏡觀察并拍攝圖像。激發光為405 nm 氬離子激光，檢測波長BP 420 ～470 nm。物鏡為63 倍油鏡，針孔直徑為1 μm。掃描激光強度為8%，觀察細胞核形態，以細胞皺縮、核固縮、染色質凝聚和熒光強度增強等作為凋亡細胞指征。

3 統計學處理

采用SPSS 11.5 統計分析軟件處理。數據以均數±標準差(±s)表示，組間均數比較采用單因素方差分析，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 青蒿琥酯對SGC－7901 細胞形態學的影響

倒置顯微鏡下觀察各組細胞，對照組細胞貼壁生長牢固，呈長梭形或三角形，分化較好，細胞明亮清晰，折光性好，胞質分布均勻，且在細胞中間部分有明顯的細胞核，見圖1A。不同濃度的青蒿琥酯作用24 h 后，細胞貼壁不牢，細胞脫落，懸浮細胞增多，細胞變圓，體積變小，伴核固縮，染色質濃縮致密，胞質內分泌顆粒增多，細胞折光性下降，可見大量細胞碎片，見圖1B、C、D。

2 原子力顯微鏡觀察藥物作用后細胞表面形貌的變化

應用原子力顯微鏡在大氣中對4 組細胞掃描成像，獲得了各組單個細胞的拓撲形貌圖和三維結構圖，并對細胞表面超微結構進行掃描分析。結果發現，與對照組相比，3 組加藥組的細胞形態明顯不同。掃面范圍為40 μm×40 μm，對照組的細胞鋪展的舒展，核區飽滿，膜表面平坦光滑，見圖2A、E;而3 組加藥組細胞逐漸萎縮，核區發生明顯塌陷，核區高度依次降低，見圖2M、N、O、P，且膜表面形成了明顯的孔洞，凹陷和裂隙。隨藥物濃度的加大，孔洞直徑加大，數量增多，見圖2B、C、D、F、G、H。利用原子力顯微鏡自帶的分析軟件Nanoscope Analysis 測量核區高度:對照組(1280.41 ±82.52)nm 顯著高于2.5 μmol/L ART 組(855.38 ±76.88)nm，5 μmol/L ART組(742.82 ±39.82)nm 和10 μmol/L ART 組(648.25 ±34.01)nm，P ＜0.05，見表1。這說明藥物使腫瘤細胞的膜表面形貌和細胞核形態均產生了變化。

Figure 1. Morphological changes of SGC - 7901 cells treated with different concentrations of ART for 24 h (×200).A:control;B:2.5 μmol/L ART;C:5 μmol/L ART;D:10 μmol/L ART.圖1 不同濃度的青蒿琥酯處理SGC－7901 細胞24 h 后細胞形態的變化

為了進一步探索細胞膜結構與藥物之間的關系，用AFM 獲取細胞表面精細結構發現，AFM 能清楚地觀察到細胞表面布滿顆粒狀物質，且顆粒形態有明顯差異。對照組表面顆粒較密集，有的呈條索狀，有的聚集成團，堆積較為緊湊，見圖2I。而加藥組細胞表面有明顯的陷窩，顆粒稀少，分布較疏松，見圖2J、K、L。細胞表面粗糙度是與細胞形貌相關的重要參數之一，通過分析軟件測量得到超微結構參數值，見表1。與對照組細胞膜表面的平均粗糙度(average roughness，Ra)和均方粗糙度(root mean square roughness，Rq)(Rq = 89.96 nm ±8.90 nm，Ra= 74.20 nm ±8.05 nm)相比，隨藥物濃度的增加，2.5 μmol/L ART 組(Rq = 59.28 nm ± 7.65 nm，Ra = 46.98 nm ±6.54 nm)，5 μmol/L ART 組(Rq = 53.28 nm±6.98 nm，Ra = 42.28 nm± 6.77 nm)和10 μmol/L ART 組(Rq = 49.36 nm ±6.81 nm，Ra=38.86 nm± 5.38 nm)均降低(P ＜0.05)。目前認為AFM 觀察到得這些膜表面顆粒是細胞表面蛋白質、脂、糖等生物大分子的超微表征，它們在細胞生命活動中發揮著重要作用。粗糙度是細胞形貌的超微結構重要參數之一，已證實細胞表面粗糙度的大小與細胞骨架的完整性相關［11］。我們推測粗糙度的降低可能是藥物作用于膜表面分子，使細胞骨架發生重排，導致細胞呈現不同的形貌，而這些形貌的改變被認為是與細胞粘附、增殖等特性密切相關的［12-13］。由AFM 獲得的以上這些定量的數據是無法由其它高分辨率成像儀器(例如透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡和激光共聚焦掃描顯微鏡)獲得的。

Figure 2. AFM morphological images of SGC-7901 cells treated with different concentrations of ART for 24 h. A，E，I，M:control;B，F，J，N:2.5 μmol/L ART;C，G，K，O:5 μmol/L ART;D，H，L，P:10 μmol/L ART. A ～D:topography (40 μm×40 μm);E ～H:three-dimensional morphological images;I ～L:ultrastructure of the corresponding areas in A ～D;M ～P:height profiles along the corresponding lines in A ～D.圖2 不同濃度的青蒿琥酯處理24 h 后各組細胞的原子力顯微鏡形貌圖

表1 不同濃度的青蒿琥酯作用下SGC－7901 細胞的各種超微結構參數Table 1. Ultrastructure parameters of SGC -7901 cells treated with different concentrations of ART(nm. ±s.n=6)

表1 不同濃度的青蒿琥酯作用下SGC－7901 細胞的各種超微結構參數Table 1. Ultrastructure parameters of SGC -7901 cells treated with different concentrations of ART(nm. ±s.n=6)

* P ＜0.05 vs control.

Group Mean height Surface root mean square roughness Surface average roughness Control 1280.41±82.52 89.96±8.90 74.20±8.05 2.5 μmol/L ART 855.38±76.88* 59.28±7.65* 46.98±6.54*5 μmol/L ART 742.82±39.82* 53.28±6.98* 42.28±6.77*10 μmol/L ART 648.25±34.01* 49.36±6.81* 38.86±5.38*

3 流式細胞術檢測細胞凋亡

經流式細胞術分析，2.5、5 和10 μmol/L ART 作用于SGC -7901 細胞24 h 后，細胞凋亡率分別為(9. 80 ±0. 99)%、(17. 70 ±1. 87)% 和(21. 20 ±2.28)%，細胞凋亡率逐漸增加，與對照組［(6.90 ±0.69)%］相比，均有顯著差異(P ＜0.05)，見表2。

表2 各組凋亡率比較Table 2. Comparison of the apototic rate in each group (%. ±s.n=6)

表2 各組凋亡率比較Table 2. Comparison of the apototic rate in each group (%. ±s.n=6)

* P ＜0.05 vs control.

Group Apotosis rate Control 6.90 ±0.69 2.5 μmol/L ART 9.80 ±0.99*5 μmol/L ART 17.70 ±1.87*10 μmol/L ART 21.20 ±2.28*

4 DAPI 熒光染料染色觀察細胞核形態

激光共聚焦顯微鏡顯示，對照組細胞形態規則，偶有凋亡細胞，見圖3A。ART 作用24 h 后，加藥組呈現出許多凋亡細胞的形態:細胞皺縮，核呈波紋狀，折縫樣或菊花狀，部分染色質出現濃縮狀態，見圖3B;細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化，核膜裂解、染色質分割成塊狀，見圖3C;細胞凋亡晚期細膜依然完整，核裂解為碎塊，形成膜包被的細胞碎片產生凋亡小體，見圖3D。

Figure 3. The apoptosis of SGC -7901 cells treated with different concentrations of ART observed under laser scanning confocal microscope (DAPI staining).A:control;B:2.5 μmol/L ART;C:5 μmol/L ART;D:10 μmol/L ART.圖3 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察不同濃度青蒿琥酯誘導的SGC－7901 細胞的凋亡情況

討 論

本研究利用AFM 高分辨的成像特點，選取人胃癌細胞株SGC-7901 為研究對象，通過作用不同濃度的抗腫瘤藥物青蒿琥酯，觀察藥物對腫瘤細胞表面形貌的影響。AFM 結果顯示:加藥組細胞核發生萎縮和塌陷，核區高度明顯下降，我們推測細胞出現了凋亡形態學的改變，結合流式細胞儀檢測到的青蒿琥酯誘導細胞凋亡，激光共聚焦顯微鏡在形態學上進一步證明了細胞發生了凋亡，形成了凋亡的典型形態-凋亡小體。提示AFM 圖像的細胞核區的變化可能正是細胞形態隨凋亡的發展而發生的相應改變，凋亡過程中伴隨一系列的形態學變化，當藥物濃度較低時，細胞核出現凋亡的早期變化，即細胞脫離臨近細胞，胞質及胞漿濃縮，染色質固縮，AMF 圖像觀察到細胞萎縮，核高度降低;隨藥物濃度的加大，出現凋亡核碎裂、核微塊等，細胞核完全崩解，所以AMF 圖像觀察到細胞核萎縮，坍塌，核區高度進一步的降低。由此可見，細胞凋亡的發生、發展與AFM 圖像的核區變化呈對應關系。我們還觀察到細胞膜表面形成了明顯的孔洞和凹陷;隨藥物濃度的增加，空洞變大，數量也增多。這是細胞膜完整性受到破壞的表現，必將改變細胞內外的離子環境，影響正常的生化過程，提示藥物可能有改變膜通透性的作用。因為藥物促進腫瘤細胞凋亡的途徑可能是多方面的。通過超微結構觀察到加藥組細胞顆粒狀物質的形態有明顯差異，膜表面粗糙度降低。細胞表面粗糙度是與細胞形貌相關的重要參數之一，已證實細胞表面粗糙度的大小與細胞骨架的完整性相關。細胞骨架是真核細胞中的蛋白質纖維網絡系統，構成細胞的骨骼，支持著整個細胞，它緊貼在細胞膜下，賦予細胞一定的形狀，對細胞及細胞器的運動也起著至關重要的作用。細胞骨架包括3 種類型，即微絲、中間纖維及微管。微絲的主要構成成分是肌動蛋白(actin)，在細胞內以兩種形式存在:聚合態(fibrous actin，F-actin)和游離態(globular actin，G-actin)，F-actin 呈纖維狀，參與維持細胞的形態、賦予質膜機械強度，細胞的運動，胞質分裂，肌肉收縮等多種功能，其結構重排及聚合和解聚的變化，在一定程度上反映了細胞的功能狀況。F -actin 能夠解聚成G -actin，G -actin 也能夠聚合成F -actin，這個過程是可逆的。正常情況下細胞內的兩種肌動蛋白處于動態平衡狀態，當受到一定的刺激后，細胞內游離的G-actin 彼此結合形成F-actin，進而通過自身螺旋組裝形成微絲，此過程即細胞的骨架重排。微絲的重組裝與分布，為細胞內外信息傳遞提供分子橋梁，控制細胞形態、運動、增殖等生物效應。細胞骨架的改變是細胞凋亡的一個重要標志［14］。藥物誘導腫瘤細胞發生凋亡的途徑可能是多方面的，其中有可能是通過細胞骨架來實現的。而另一方面，細胞凋亡的發生、發展也需要依賴細胞骨架結構和功能的完整性，細胞凋亡過程中伴隨的一系列形態學改變，如凋亡細胞從周圍細胞中脫離、胞質出芽、凋亡小體的形成等也都是與細胞骨架系統密不可分［15-16］。

Ehrenhoefer 等［17］提出AFM 觀測到的細胞膜表面的這些顆粒很可能是膜表面的蛋白質、脂、糖等的單體或聚集體等特化結構。在細胞的生命活動中，膜磷脂雙分子層內富含鞘脂類和膽固醇的細胞膜微結構域，可選擇性地募集某些蛋白分子，此微結構域像“筏”一樣，在細胞膜表面可側向移動，故而被稱為脂筏(lipid raft)。脂筏區含有很多的脂質及蛋白質組分，在細胞膜轉運和細胞信號轉導過程中發揮著重要作用，當參與信號轉導和蛋白質運轉時，其構像也會發生相應的轉化和優化，有利于蛋白質之間的相互作用。van Meer 等［18］在誘導凋亡的藥物實驗中發現，脂伐參與配體、受體和激酶之間相互作用所激發的細胞信號轉導而激活凋亡途徑。因此我們推測青蒿琥酯與脂伐內凋亡有關的信號分子結合，使蛋白質發生變構，啟動細胞內信號轉導的級聯反應而誘導靶細胞凋亡，具體機制有待進一步研究。

本研究利用原子力顯微鏡在納米級分辨率下觀察到抗腫瘤藥物對腫瘤細胞膜超微結構的影響，為研究抗腫瘤藥物與細胞膜的相互作用提供新的思路，使原子力顯微鏡發展成為研究生命科學的一個有力工具，為揭示藥物的作用機制提供可視化參考。如果將AFM 和其它儀器設備(如透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡、激光共聚焦掃描顯微鏡、生物質譜、核磁共振等)有機地結合起來，相互補充，取長補短，一定會獲得很好的研究結果。

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