長期培養的人臍帶間充質干細胞PCNA、IL－6、IL－11 和galectin－3 的表達*

毛文哲， 許 超， 李揚秋， 陳少華， 柳 菁， 劉 俊， 廖繼東△

(暨南大學醫學院1田家炳醫學實驗中心，2血液病研究所，3生物化學教研室，廣東 廣州510632)

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一群中胚層來源的具有自我更新和多向分化潛能的多能成體干細胞，在細胞治療、組織修復、基因治療等方面顯示出巨大的應用潛力。人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC－MSCs)具有含量豐富、取材方便的特征，其采集過程對母胎均無不良影響，是理想的MSCs 來源［1］。

hUC－MSCs 較骨髓等其它組織來源MSCs 具有更強的分化增殖能力、更低的免疫原性，在體外連續培養達80 個細胞倍增時間可仍保持其多向分化潛能和增殖能力［2－3］。有學者采用基因芯片掃描不同培養條件下50 d 傳代培養的人骨髓MSCs，顯示其基因表達譜隨培養時間的增加而波動幅度增大［4］。我們曾報道在常規體外培養環境下，隨著傳代次數的遞增，hUC－MSCs 的增殖及粘附能力下降，細胞凋亡率增加，生物學活性呈逐漸下降趨勢［5］。已知MSCs發揮其造血支持、免疫調節功能與細胞因子密切相關［6－7］。本研究進一步分析hUC－MSCs 在長期培養傳代過程中增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、白細胞介素－6 (interleukin－6，IL－6)、IL－11 和半乳糖凝集素－3(galectin－3)mRNA 及蛋白表達趨勢，為hUC－MSCs 的實驗研究和臨床應用提供實驗資料和理論依據。

材 料 和 方 法

1 材料和試劑

無菌條件下采集足月剖宮產胎兒臍帶6 份，均征得產婦及家屬的同意，由暨南大學第一附屬醫院婦產科提供;DMEM/F12 培養基和胎牛血清購自Gibco;人臍帶間充質干細胞成骨、成脂誘導分化培養基購自Cyagen;RNAsimple Total RNA Kit、TIANScript RT Kit、2 ×Taq Platinum PCR MasterMix 和RealMasterMix(SYBR GreenⅠ)購自北京天根生化科技有限公司;人IL－6 和人IL－11 定量檢測試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司;RIPA 裂解液購自上海碧云天生物科技研究所;galectin－3 和β－actin 抗體購自北京博奧森生物技術有限公司;所有引物由英維捷基貿易有限公司合成。

2 hUC－MSCs 的分離、傳代和生物學特征鑒定

取8 cm 無菌臍帶組織，PBS 洗除余血，剪成約1 mm×1 mm×1 mm，經0.2%膠原酶Ⅱ37 ℃振蕩消化2 h，過濾收集細胞，用含10%FBS 的DMEM/F12溶液按2.4 ×104cells/cm2密度接種于康寧25 cm2塑料培養瓶，置37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。當培養細胞達90%融合時，用0. 25% 胰酶消化，并按同一細胞密度傳代。收集第3、28 代細胞，用流式細胞儀檢測細胞表型。同時另取適量細胞于內含膠原蛋白處理無菌蓋玻片的6 孔板內，如前繼續培養。成骨誘導組24 h 后將培養基更換為成骨誘導分化培養基(含DMEM/F12、10%胎牛血清、青霉素－鏈霉素雙抗、L－谷氨酰胺、抗壞血酸鹽、β－甘油磷酸及地塞米松)，每3 d 換1 次液，2 ～3 周后，茜素紅染色鑒定;成脂誘導組待細胞達到過融合狀態時，將培養基更換為成脂誘導分化培養基A 液(含DMEM/F12、10%胎牛血清、青霉素－鏈霉素雙抗、L－谷氨酰胺、胰島素、IBMX、吲哚美辛及地塞米松)，3 d 后更換為B 液(含DMEM/F12、10%胎牛血清、青霉素－鏈霉素雙抗、L－谷氨酰胺和胰島素)，24 h 后再次更換A 液，如此循環3 ～5 次后，以B 液培養7 d，油紅O 染色鑒定。

3 qRT－PCR 檢測PCNA、IL－6、IL－11 和galectin－3 mRNA 表達

分別收集第3、8、18、28、33 代達90%融合狀態的hUC－MSCs，按天根RNAsimple Total RNA Kit 提取RNA，TIANScript RT Kit 合成cDNA，用前按101，102，103，104稀釋。根據GenBank 數據庫，由Primer premier 5.0 軟件設計、公司合成人PCNA、IL－6、IL－11、galectin－3 和β2－微球蛋白(β2－microglobulin，β2M)引物。引物序列和預計擴增片段長度見表1。根據Real Master Mix(含SYBR GreenⅠ)配置PCR反應體系，95 ℃3 min 30 s，95 ℃15 s，Tm 30 s，70 ℃1 min 15 s，讀板，共44 個循環。結果以擴增循環數(Ct 值)為縱坐標，各稀釋度的對數值為橫坐標繪制標準曲線。觀察擴增動力學曲線和溶解曲線，用公式2－ΔΔCt方法進行相對定量，計算得出目的基因相對于管家基因β2M 的量。

表1 引物序列Table 1. Sequences of the primers

4 ELISA 檢測細胞培養上清IL－6 和IL－11 含量

按1 ×108cells/L 濃度接種hUC－MSCs 于6 孔板中，當細胞達90%融合時，收集上清，按人IL－6和IL－11 定量檢測試劑盒操作分別檢測第3、8、18、28、33 代細胞的IL－6 和IL－11 分泌量。

5 Western bloting 檢測galectin－3 蛋白表達

采用RIPA 裂解液分別抽提第3、8、18、28、33 代hUC－MSCs 總蛋白。用10%分離膠SDS－PAGE 電泳，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉4 h，加Ⅰ抗孵育，標記結合Ⅱ抗，ECL 熒光顯色定影。

6 統計學處理

用SPSS 16.0 統計軟件進行分析。數據用均數±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著差異法(LSD 法)。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 hUC－MSCs 的形態及生長特性

經膠原酶消化分離的人臍帶細胞接種24 h 后貼壁，3 d 后細胞形態呈多邊形或長梭形，同時含有部分雜細胞，見圖1A。傳至第3 代時細胞呈長梭形、大小均一平行排列為螺旋狀或旋渦狀的成纖維母細胞樣，見圖1B。繼續培養至第23 代，細胞形態無明顯變化，見圖1C。當培養至第28 代時，細胞生長速度減緩，細胞變大，形態雜亂，見圖1D。

Figure 1. Morphology of human umbilical cord mesenchymal stem cells at different passages (×100). A:primary cells;B:passage 3;C:passage 23;D:passage 28.圖1 不同代人臍帶間充質干細胞的形態

2 hUC－MSCs 的分化能力

第3 代和第28 代hUC－MSCs 經成骨誘導分化培養后，茜素紅染色細胞間可見大量的紅色鈣化基質沉積，見圖2A、B;經成脂誘導分化培養后，油紅O染色，細胞內可見紅色脂滴，見圖2C、D，表明它們均具有向成骨細胞和脂肪細胞分化的潛能。

Figure 2. Osteogenic (A，B;alizarin red staining，×100)and lipogenic (C，D;oil red O staining，×200)differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells at the 3rd (A，C)and 28th (B，D)passages.圖2 第3、28 代人臍帶間充質干細胞的成骨和成脂分化

3 hUC－MSCs 的表型

流式細胞術檢測顯示體外培養第3 代和第28代hUC－MSCs 的細胞表型均為:CD29+/CD44+/CD105+/CD31－/CD34－/CD40－/CD45－/CD106－/HLA－DR－，見圖3A、B。

4 不同代hUC－MSCs PCNA mRNA 的表達

不同代hUC－MSCs 的qRT－PCR 檢測結果見表2，隨著傳代次數的增加，PCNA mRNA 的表達量逐漸降低，第28、33 代細胞與第3、8、18 代相比差異有統計學意義(P ＜0.05 或P ＜0.01)，第33 代較第3 代降低了33%(P ＜0.01)。

5 不同代hUC－MSCs IL－6 的mRNA 表達和蛋白分泌

不同代hUC－MSCs 的qRT－PCR 檢測結果見表2，隨著傳代次數的增加，IL－6 mRNA 逐漸降低，第28、33 代與第3、8、18 代相比差異顯著(P ＜0.05 or P ＜0.01)，第33 代較第3 代IL－6 mRNA 的表達量降低了56%(P ＜0.01)。ELISA 檢測結果見表3，隨著傳代次數的增加，IL－6 蛋白分泌量也逐漸降低，第28、33 代與第3、8、18 代相比差異顯著(P ＜0.01)，第33 代較第3 代降低了50.3%(P ＜0.01)。

6 不同代hUC－MSCs IL－11 的mRNA 表達和蛋白分泌

Figure 3. The surface markers of human umbilical cord mesenchymal stem cells at the 3rd and 28th passages detected by flow cytometry. A:passage 3;B:passage 28.圖3 流式細胞術檢測第3 代和第28 代人臍帶間充質干細胞表型

表2 不同代人臍帶間充質干細胞的PCNA 、IL－6、IL－11 和galectin－3 mRNA 表達量Table 2. Expression of PCNA，IL－6，IL－11 and galectin－3 mRNA in different passages of human umbilical cord mesenchymal stem cells (±s.n=6)

表2 不同代人臍帶間充質干細胞的PCNA 、IL－6、IL－11 和galectin－3 mRNA 表達量Table 2. Expression of PCNA，IL－6，IL－11 and galectin－3 mRNA in different passages of human umbilical cord mesenchymal stem cells (±s.n=6)

* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs passage 3;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs passage 28;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs passage 33.

Group PCNA IL－6 IL－11 Galectin－3 Passage 3 1##△△ 1##△△ 1##△△1 Passage 8 0.99 ±0.18#△△ 0.99 ±0.24##△△ 1.24 ±0.37##△△ 1.07 ±0.17 Passage 18 0.98 ±0.15##△△ 0.63 ±0.17＊＊#△ 0.88 ±0.15* ##△△ 1.02 ±0.19 Passage 28 0.76 ±0.18＊＊ 0.42 ±0.22＊＊ 0.69 ±0.11＊＊ 1.01 ±0.25 Passage 33 0.67 ±0.15＊＊ 0.44 ±0.14＊＊ 0.63 ±0.14＊＊0.97 ±0.16

表3 不同代人臍帶間充質干細胞的IL－6 和IL－11 分泌量Table 3. Secretion of IL－6 and IL－11 in different passages of human umbilical cord mesenchymal stem cells (ng/L.±s.n=6)

表3 不同代人臍帶間充質干細胞的IL－6 和IL－11 分泌量Table 3. Secretion of IL－6 and IL－11 in different passages of human umbilical cord mesenchymal stem cells (ng/L.±s.n=6)

* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs passage 3;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs passage 28;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs passage 33.

Group IL－6 IL－11 Passage 3 211.44±30.20##△△ 147.23±12.20##△△Passage 8 206.59±28.50##△△ 157.87±13.60##△△Passage 18 144.94±17.10＊＊#△△ 118.85±10.20＊＊##△△Passage 28 118.14±15.80＊＊ 50.10±6.10＊＊△Passage 33 105.01±12.20＊＊ 60.39±5.90＊＊

不同代hUC－MSCs的qRT－PCR 檢測 結果見表2，隨著傳代次數的增加，IL－11 mRNA 逐漸降低，第18、28、33 代與第3、8 代相比差異顯著(P ＜0.05 or P ＜0.01)，第33 代較第3 代表達量降低了37%(P ＜0.01)。ELISA 檢測結果見表3，隨著傳代次數的增加，IL－11 蛋白分泌量也會逐漸降低，第28、33代與第3、8、18 代相比差異顯著(P ＜0.01)，第33 代較第3 代降低了58.9%(P ＜0.01)。

7 不同代hUC－MSCs galectin－3 mRNA 和蛋白的表達

不同代hUC－MSCs 的qRT－PCR 檢測結果見表2，顯示各代細胞之間galectin－3 mRNA 表達量無顯著差異(P ＞0.05)。Western bloting 結果見圖4，顯示各代間galectin－3 蛋白條帶亮度無明顯差異。

Figure 4. Expression of galectin－3 protein in different passages of human umbilical cord mesenchymal stem cells. 1:passage 3;2:passage 8;3:passage 18;4:passage 28;5:passage 33.圖4 不同代人臍帶間充質干細胞galectin－3 蛋白的表達

討 論

MSCs 源自發育早期的中胚層，存在于多種機體組織內，具有來源廣泛、取材容易、分離純化程序簡單，便于體外長期傳代培養擴增和保存等優點，已成為替代治療和基因治療領域中極具實用價值的干細胞。MSCs 能釋放大量細胞因子，在機體內相互促進或相互抑制，形成十分復雜的細胞因子調節網絡［8］，對于MSCs 發揮造血支持、免疫調節、組織修復等功能具有重要意義。本文分析常規條件下長期傳代培養hUC－MSCs 的功能相關細胞因子PCNA、IL－6、IL－11 和galectin－3 mRNA 和蛋白表達變化情況，探討hUC－MSCs 相關功能在長期培養過程中的變化趨勢，為獲取具有最佳性能的hUC－MSCs 或選擇適當的細胞因子作干細胞治療輔助手段提供實驗資料和理論依據。

從正常剖宮產胎兒臍帶華氏膠組織中提取細胞，經塑料培養瓶貼壁、傳代培養3 代后細胞呈均一的梭形成纖維母細胞樣聚集分布，傳代至第23 代時細胞形態無明顯變化，而傳代至第28 代時細胞有老化現象，繼續傳代至第33 代時老化現象尤其突出，細胞形體較大，碎片較多，生物學活性明顯降低，細胞生長不能維持到誘導分化所需的時間。為鑒定培養傳代起始和后期細胞的生物學特性，取第3 代和第28 代細胞進行細胞表型和誘導分化能力的鑒定。第3 代和第28 代細胞表型均為CD29+/CD44+/CD105+/CD31－/CD34－/CD40－/CD45－/CD106－/HLA－DR－，且均可向成骨和脂肪細胞分化，證實我們從臍帶中分離培養的細胞符合首屆胎盤來源干細胞國際研討會及國際細胞治療協會關于MSCs 的標準［9］，且可傳代培養至第33 代，第28 代仍保持MSCs 表型和分化能力。

PCNA 是真核細胞DNA 聚合酶δ 的輔助蛋白，參與細胞增殖過程DNA 的合成，是反映細胞增殖活性的良好標志物［10］，實驗結果顯示PCNA mRNA 表達隨著培養時間的增加而減少，第33 代較第3 代PCNA mRNA 表達量降低了33%，差異顯著(P ＜0.01)，證實長期傳代培養的hUC－MSCs 增殖能力隨著培養時間的增加而下降，與我們報道的長期傳代培養的hUC－MSCs 生物學活性呈逐漸下降趨勢的結果一致［5］。

MSCs 作為造血微環境主要細胞成分的來源，通過與造血細胞直接接觸、分泌細胞外基質及多種細胞因子維持造血微環境結構和功能的完整性，進而實現對造血的精細調控［11］。MSCs 與造血干細胞聯合移植可促進造血重建［12］。Majumdar 等［13］研究發現骨髓MSCs 穩定的表達多種造血相關因子，支持長期造血活動。Friedman 等［14］進一步證實hUC－MSCs 分泌的造血相關細胞因子(粒細胞集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞刺激因子、肝細胞生長因子、白細胞抑制因子、IL－1a、IL－6、IL－8、IL－11)較骨髓MSCs 多。本實驗發現體外長期培養hUC－MSCs IL－6 及IL－11 的mRNA 和蛋白表達會隨細胞代數發生改變。第33 代較第3 代IL－6 和IL－11 mRNA及蛋白表達量均明顯降低(均P ＜0.01)，提示hUC－MSCs 的造血支持能力可能隨著體外長期培養傳代而降低，因此在臨床應用時需考慮此因素。

MSCs 除了具有支持造血的功能外，還具有獨特的免疫學特性，在體外不僅能誘導免疫應答，而且還具有抑制免疫反應的作用。MSCs 免疫調節的機制主要涉及兩個方面，一方面是細胞的接觸機制，另一方面是非細胞接觸機制，即細胞因子的分泌和細胞蛋白的表達。Sioud 等［15］研究發現，galectin－3 是MSCs 發揮免疫抑制功能的重要調節分子，MSCs 表達的galectin－3 可以抑制同種異體T 細胞增殖。本實驗顯示，在體外長期傳代培養過程中hUC－MSCs galectin－3 mRNA 的表達無明顯變化，且各代細胞間galectin－3 蛋白的表達亦無明顯差異，這是否意味著體外長期傳代培養對hUC－MSCs 的免疫調節功能沒有影響，這有待進一步探討。

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