維甲酸對轉化生長因子β1誘導的HFL－I 細胞Ⅲ型膠原、STAT3 和PIAS3 表達的影響*

夏 武， 楊宇平， 陳永鳳， 程 娜， 劉巨源△

(新鄉醫學院1藥學院藥理學教研室，2 第三附屬醫院呼吸內科，河南 新鄉453003)

肺間質纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是嚴重威 脅人類健康的疾病，迄今沒有滿意的治療方法［1］。PF 過程中成纖維細胞(fibroblast，FB)大量增殖并轉化為肌成纖維細胞(myofibroblast，MB)，MB 能分泌細胞外基質(extracellular matrix，ECM)，ECM 占據肺泡腔并導致肺結構不可逆重構，造成呼吸衰竭［2］。Ⅲ型膠原(collagen Ⅲ)是ECM 成分之一，在PF 時表達顯著增高。信號轉導子和轉錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)可被多種細胞因子和生長因子激活，活化的STAT3 進入核內調控基因轉錄，調節機體多種生理和病理過程?；罨疭TAT 蛋白抑制劑(protein inhibitor of activated STAT3，PIAS3)能特異性抑制STAT3 蛋白活性，阻斷STAT3 與靶基因結合。STAT3 在纖維化疾病中的作用還不清楚，有研究發現STAT3 對肝臟、皮膚和腎臟的纖維化形成有調節作用。全反式維甲酸(all－trans－retinoic acid，ATRA)作用廣泛多樣，已有研究證實ATRA 具有抗纖維化作用，ATRA 能否通過影響STAT3 和PIAS3 的表達來改善PF 未見報道。因此本研究采用轉化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF－β1)誘導FB 向MB 轉化制作肺纖維化體外細胞模型并給予ATRA 干預，應用RT－PCR 和Western blotting 方法觀察ATRA 對TGF－β1誘導的HFL－I 細胞中collagen Ⅲ、STAT3和PIAS3 表達的影響，探討ATRA 改善肺纖維化的機制。

材 料 和 方 法

1 試劑與儀器

人胚肺成纖維HFL－I 細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心;ATRA 購于Sigma，DMSO 溶解，現配現用;TGF－β1購于Peprotech，10 mmol·L－1HCl 溶解，現配現用;RT－PCR試劑盒購于寶生物(大連)有限公司;單克隆小鼠抗β－actin、STAT3 抗體和多克隆兔抗p－STAT3 抗體購于Santa Cruz;羊抗小鼠、羊抗兔－HRP 購自武漢博士德公司;PCR 擴增儀為ABI 產品;電泳儀、轉膜儀為北京六一儀器廠產品;凝膠成像系統為上海領成生物科技有限公司產品;酶標儀為Thermo 產品。

2 方法

2.1 細胞培養與處理 HFL－I 細胞株采用含15%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、青霉素(100 kU·L－1)、鏈霉素(100 mg·L－1)的α－MEM 培養液，并于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養至對數生長期。所有實驗均采用5 ～7 代細胞。5 μg·L－1TGF－β1刺激0 h、6 h、12 h、24 h、48 h 和72 h 后，RT－PCR法檢測collagen Ⅲ、STAT3 和PIAS3 mRNA 表達，刺激0 d、1 d、3 d 和5 d 后，Western blotting 法檢測STAT3 和pSTAT3 表達。維甲酸干預實驗分為6 組:正常對照組;5 μg·L－1TGF－β1組;10 μmol·L－1ATRA 組;5 μg·L－1TGF－β1+ 0.1 μmol·L－1ATRA 組;5 μg·L－1TGF－β1+ 1 μmol·L－1ATRA組;5 μg·L－1TGF－β1+ 10 μmol·L－1ATRA 組。TGF－β1與ATRA 同時加入。24 h 后，RT－PCR 法檢測各組細胞中collagen Ⅲ、STAT3 和PIAS3 mRNA表達;3 d 后，Western blotting 法檢測STAT3 和pSTAT3 蛋白表達。

2.2 RT－PCR 檢測collagen Ⅲ、STAT3 和PIAS3 mRNA 表達 Trizol 法提取細胞總RNA 并定量。取總RNA 2 μg 進行逆轉錄反應，各取2 μL 產物進行PCR反應擴增GAPDH、collagen Ⅲ、STAT3 和PIAS3。PCR擴增條件為:95 ℃5 min 預變性;95 ℃30 s，退火30 s，72 ℃1 min，30 個循環;72 ℃10 min。反應后各取2 μL PCR 產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以目的片段與內參照GAPDH 比值進行半定量分析，每組實驗重復3 次。引物序列、退火溫度和產物大小見表1。

表1 PCR 引物序列、退火溫度和產物大小Table 1. Primers and PCR reaction conditions

2.3 Western blotting 檢測STAT3 和p－STAT3 蛋白表達 細胞總蛋白提取方法如下:加入細胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃12 000 r·min－1離心5 min，取上清。Bradford 法測定蛋白濃度。計算含20 μg總蛋白的溶液體積作為上樣量，進行SDS－PAGE 電泳，轉移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。STAT3 和p－STAT3Ⅰ抗室溫孵育2 h 后4 ℃過夜，HRP 標記的Ⅱ抗室溫孵育1 h 后，加顯色液發光，顯影定影。將膠片掃描后用Quantity One 圖像分析軟件進行各條帶的灰度值測定。以目的條帶與內參照β－actin 的比值作為半定量依據，每組實驗重復3 次。

3 統計學處理

結 果

1 TGF－β1 和ATRA 對HFL－I 細胞collagen Ⅲ、STAT3 和PIAS3 mRNA 表達的影響

從圖1 中可看出，與正常對照組相比，HFL－Ⅰ細胞經5 μg·L－1TGF－β1誘導后，collagen ⅢmRNA 12 h、24 h 和48 h 均明顯上調(P ＜0.05)，24 h達到峰值;STAT3 mRNA 各時點均明顯上調(P ＜0.05)，24 h 達到峰值;PIAS3 mRNA 12 h、24 h、48 h 和72 h 均明顯下調(P ＜0.05)，48 h 達到峰谷，72 h 部分回升。從圖2 中可知，與正常對照組相比，TGF－β1誘導HFL－I 細胞經24 h 后，collagen Ⅲ、PIAS3 和STAT3mRNA 表達均與圖1 一致;經10 μmol·L－1ATRA 作用24 h 后，collagen Ⅲ、PIAS3 和STAT3 mRNA表達差異無統計學意義。與TGF－β1誘導組相比，不同濃度ATRA(0.1、1 和10 μmol·L－1)均可下調誘導細胞中collagen Ⅲ和STAT3 mRNA 的表達(P ＜0.05)，上調PIAS3 mRNA 的表達(P ＜0.05)。

2 TGF－β1 和ATRA 對HFL－Ⅰ細胞STAT3 和p－STAT3 蛋白表達的影響

如圖3 所示，與正常對照組相比，HFL－Ⅰ細胞經5 μg·L－1TGF－β1誘導1 d、3 d 和5 d 后，STAT3和p－STAT3 蛋白表達明顯上調(P ＜0.05)。由圖4可知，與正常對照組相比，TGF－β1誘導HFL－Ⅰ細胞3 d 后，STAT3 和p－STAT3 蛋白表達明顯上調(P＜0.05)，經10 μmol·L－1ATRA 作用3 d 后，STAT3蛋白表達差異無統計學意義，p－STAT3 蛋白表達稍有 上調(P ＜0.05)。與TGF－β1組相比，不同濃度ATRA(0.1、1 和10 μmol·L－1)均可下調TGF－β1誘導的STAT3 和p－STAT3 蛋白的表達(P ＜0.05)。

Figure 1. The expression of collagen Ⅲ，STAT3 and PIAS3 mRNA in TGF－β1－stimulated HFL－I cells detected by RT－PCR. ±s.n=3. * P ＜0.05 vs 0 h.圖1 RT－PCR 檢測TGF－β1 誘導的HFL－I 細胞collagen Ⅲ、STAT3 和PIAS3 mRNA 的表達

Figure 2. Relative expression of collagen Ⅲ，STAT3 and PIAS3 mRNA in the TGF－β1－stimulated HFL－I cells treated with ATRA. Lane 1:10 μmol·L －1 ATRA;Lane 2:TGF－β1 + 0.1 μmol·L －1 ATRA;Lane 3:TGF－β1 + 1 μmol·L －1 ATRA;Lane 4:TGF－β1 + 10 μmol·L －1 ATRA;Lane 5:TGF－β1;Lane 6:control. ±s.n =3. * P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs TGF－β1 group.圖2 RT－PCR 檢測ATRA 對TGF－β1 誘導的HFL－I collagen Ⅲ、STAT3 和PIAS3 mRNA 表達的影響

討 論

大多數PF 都有共同的病理過程，初期表現為肺泡炎，炎癥和異常修復導致肺間質細胞增殖，產生大量的細胞外基質，導致肺組織的正常結構被囊性空腔所替代，使得肺泡氣體－ 交換單元持久性喪失。PF 時肺結締組織中存在大量纖維化灶，其中含大量MB，MB 是產生ECM 的主要細胞，也與ECM 沉積相關。PF 時還有大量細胞因子和生長因子活化，包括TGF－β1、表皮細胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)、結締組織生長因子(conneetive tissue growth factor，CTGF)、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)和白細胞介素－6(interleukin－6，IL－6)等，這些細胞因子和生長因子都具有促纖維化作用［3－4］。TGF－β1是至關重要的纖維化因子，TGF－β1可以誘導肺間質FB 發生表型轉化變成MB。Vancheri 等［5］在體外實驗證實了TGF－β1可誘導肺成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化。

本實驗組前期工作顯示5 μg·L－1TGF－β1可以使HFL－I 細胞α－平滑肌肌動蛋白表達明顯增加［6］，α－平滑肌肌動蛋白是MB 的標志性蛋白［7］，表明FB 部分向MB 轉化，而且慢性纖維化疾病患者血清中的TGF－β1濃度接近5 μg·L－1［8］，所以本實驗用5 μg·L－1TGF－β1誘導HFL－I 細胞向MB轉化，制造體外PF 模型。

Figure 3. Relative expression of STAT3 and p－STAT3 proteins in TGF－β1－stimulated HFL－I cells detected by Western blotting.±s.n=3. * P ＜0.05 vs 0 d.圖3 Western boltting 檢測TGF－β1 誘導的HFL－I 細胞STAT3 和p－STAT3 蛋白的表達

Figure 4. Relative expression of STAT3 and p－STAT3 proteins in the TGF－β1－stimulated HFL－I cells treated with ATRA.Lane 1:control;Lane 2:TGF－β1;Lane 3:10 μmol·L －1 ATRA;Lane 4:TGF－β1 + 0.1 μmol·L －1 ATRA;Lane 5:TGF－β1 + 1 μmol·L －1 ATRA;Lane 6:TGF－β1 + 10 μmol·L －1 ATRA. ±s.n=3. * P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 ATRA vs TGF－β1 group.圖4 Western boltting 檢測ATRA 對TGF－β1 誘導的HFL－I STAT3 和p－STAT3 蛋白表達的影響

在PF 時，MB 持續增殖，單個細胞的生存時間大大延長，包括collagen Ⅲ在內的ECM 成分含量顯著增加［9］。有研究提示，collagen Ⅲ可作為判定間質纖維化早期或活動期的較好指標［10］。本實驗研究表明TGF－β1誘導HFL－Ⅰ細胞12 h、24 h 和48 h 后collagen ⅢmRNA 表達較正常對照組相比均明顯上調(P ＜0.05)。膠原表達增加可代替肺泡結構，使肺泡壁變形和破壞，加速PF 形成。

STAT3 可以被不同的細胞因子受體激活，細胞因子與受體結合后磷酸化STAT3 蛋白，磷酸化STAT3 蛋白形成同源或異源二聚體進入核內激活特異性基因表達。PIAS3 是STAT3 的特異性抑制子，PIAS3 可以通過與二聚化的STAT3 結合、掩蓋STAT3 的DNA 結合區或與STAT3 單體結合阻礙其二聚化而阻斷STAT3 的信號轉導作用［11］。Pang等［12］研究發現STAT3 的抑制劑S3I－201 可以抑制腎纖維化時α－平滑肌肌動蛋白和纖連蛋白的表達。本研究表明TGF－β1誘導人胚肺成纖維細胞HFL－I 后，STAT3 mRNA 和蛋白表達明顯升高，磷酸化STAT3 蛋白也顯著增加，而PIAS3 mRNA 表達則明顯下調，結果都使核內活性STAT3 增加。STAT3 靶基因的表達產物如Bcl－2、生存素、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等有促進細胞生存、拮抗細胞凋亡的作用，在PF 的病程發展中有重要作用［13］?；钚許TAT3 增加，使得Bcl－2、生存素、VEGF 等表達增加，加速PF病程。

ATRA 是維生素A 在生物體內的重要活性形式，其作用復雜多樣，能促進免疫細胞增殖，影響骨的生長和上皮代謝，誘導腫瘤細胞分化等。機體內一定濃度的ATRA 可調節細胞的增殖、分化、成熟，是機體正常生長發育和各種生理活動必不可少的重要因子。在體內體外的實驗中都發現ATRA 有抗肺纖維化活性。ATRA 可以抑制肺纖維化大鼠前膠原α1mRNA 表達和膠原蛋白合成［14］。Tabata 等［15］研究表明，ATRA 可以減輕輻射和博來霉素所致小鼠肺組織纖維化，降低TGF－β1、IL－6 和膠原蛋白的表達而起抗纖維化作用。本實驗結果顯示，ATRA 呈濃度依賴地降低TGF－β1誘導的HFL－I 細胞中collagen ⅢmRNA 表達(P ＜0.05)，使膠原的合成減少而起抗纖維化作用。進一步研究發現，各濃度的ATRA都降低TGF－β1誘導的HFL－I 細胞中STAT3 mRNA 和蛋白表達及磷酸化STAT3 水平，上調PIAS3 mRNA 表達。這表明ATRA 抗纖維化作用與STAT3和PIAS3 有關，ATRA 可通過抑制STAT3 和p－STAT3 使肺纖維化相關基因活化減少來改善PF，具體調控過程與調控基因有待進一步研究。

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