Rock2 對細胞周期檢查點Cdc25A 的調節作用*

劉天德， 余 新， 袁榮發， 王慶諾， 楊志強， 邵江華，2△

(1南昌大學第二附屬醫院肝膽外科，2江西省分子醫學重點實驗室，江西 南昌330006)

Rho 相關含卷曲螺旋蛋白激酶(Rho－associated coiled－coil－containing protein kinase，Rock)是新近發現的Rho/Rock 信號轉導通路的關鍵信號分子，包括Rock1 和Rock2 亞單位［1］，其具有調節細胞的多種行為和功能，并與腫瘤惡性程度、腫瘤發生、轉移以及細胞的黏附、收縮、遷移和胞漿的分裂有關［2－3］。研究表明，Rock2 在肝癌等惡性腫瘤中表達水平異常增高［4］。我們的前期研究表明，降低肝癌細胞中Rock2 蛋白表達可以抑制肝癌細胞的增殖，并使細胞周期阻滯在G1/S 期。細胞分裂周期蛋白25A(cell division cycle 25A，Cdc25A)是控制G1/S期調節途徑的重要檢查點蛋白，在轉導級聯激活作用中是一個重要的效應分子［5］。也有研究表明，Cdc25A 在肝癌組織中呈現高表達［6］。但Rock2 與Cdc25A 蛋白之間是否存在關聯，目前尚不清楚，本研究擬探討Rock2 對Cdc25A 蛋白的調節作用。

材 料 和 方 法

1 材料

DMEM 培養基(Gibco)，胎牛血清(HyClone)，脂質體LipofectamineTM2000(Invitrogen)，羊抗多克隆Rock2Ⅰ抗(Santa Cruz)，兔抗多克隆Cdc25A Ⅰ抗(Santa Cruz)，兔抗多克隆檢查點激酶(checkpoint kinase，Chk)1Ⅰ抗(Santa Cruz)，兔抗多克隆Chk2Ⅰ抗(Santa Cruz)，Protein A/G PLUS－Agarose(Santa Cruz)。DNA 切膠回收試劑盒、質粒大量提取及小量提取試劑盒(北京天根公司)。設計的Rock2 干擾序列及相關引物由上海生工合成。pcDNA5－FRT－6×his－Rock2 質粒及pCMV－N－HA－Cdc25A 質粒已于前期構建，人肝細胞性肝癌細胞株Huh－7 和HepG2 由本實驗室保存。

2 標本

收集南昌大學第二附屬醫院肝膽外科2009 年1月～2010 年7 月肝癌及癌旁組織標本，共計51 例，收集后立即液氮保存。經病理切片證實均為原發性肝癌標本。

3 細胞株的培養及轉染

Huh－7 和HepG2 細胞株接種于含10%胎牛血清的DMEM 培養基，37 ℃、5%CO2條件下培養。按脂質體LipofectamineTM2000 轉染試劑說明進行轉染，于轉染6 h 后更換為含10%胎牛血清的DMEM 培養基。

4 MTT 法檢測肝癌細胞的增殖

在離心管內將各組細胞懸液充分打勻，按8 ×103cells/well 接種于96 孔培養板，每孔加液量200 μL，24 h 后換液，每組設6 個復孔。于轉染后1 ～4 d每孔加入5 g/L MTT 試劑20 μL，于37 ℃、5%CO2條件下繼續孵育4 h。吸取各孔上清，加入DMSO 150 μL/well，室溫下置水平搖床搖10 min 以充分溶解MTT 結晶。在酶聯免疫測定儀上選擇波長490 nm，空白孔調零，測定各孔吸光度(A)值。每組重復3 次。細胞增長率(%)=(實驗組平均A490/對照組平均A490)×100%。

5 shRock2 干擾質粒的構建及篩選

根據NCBI 上查到的人Rock2 mRNA 序列(NM_004850.3)，設計4 對寡聚單鏈DNA，連接到pcDNATM6.2－GW/EmGFPmiR 載體中，測序驗證，見表1。將4 個shRock2 質粒分別轉染入肝癌細胞Huh－7 中，48 h 后提取總蛋白，Western blotting 分析Rock2 蛋白的表達，篩選出干擾效果最佳的shRock2質粒。

表1 miRNA 寡聚單鏈DNA 序列Table 1. Oligomeric single－stranded DNA sequences

6 篩選Rock2 穩定低表達的肝癌細胞株

將上述篩選出的最佳shRock2 干擾質粒利用脂質體LipofectamineTM2000 轉染到肝癌細胞Huh－7和HepG2 中，轉染48 h 后加入殺稻瘟素(blasticidin)篩選，濃度為10 mg/L。48 h 后加入5 mg/L 殺稻瘟素繼續培養3 周，Western blotting 檢測Rock2 蛋白的變化，篩選出Rock2 穩定低表達的肝癌細胞株。

7 檢測Rock2 穩定低表達肝癌細胞中Cdc25A、Chk1 和Chk2 蛋白的變化

提取各組肝癌細胞的總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，取等量50 μg 蛋白質樣品煮沸5 min 后行10%SDS－PAGE 電泳，濕轉，然后分別結合對應Cdc25A、Chk1、Chk2Ⅰ抗及辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗，應用ECL 發光試劑顯示蛋白質條帶，暗室曝光。每組實驗共平行進行3 次。

8 Rock2 突變質粒的構建及轉染

為消除RNA 干擾技術中的脫靶效應，我們針對Rock2 干擾序列進行了堿基定點突變，見表2。以pcDNA5－FRT－6 × his－Rock2 質粒為模板，構建Rock2 突變質粒(經測序驗證)以此“恢復”Rock2 蛋白的表達，Western blotting 檢測Rock2 和Cdc25A 蛋白的變化及MTT 法觀察肝癌細胞增殖的變化。

表2 Rock2 定點突變引物Table 2. Site－directed mutagenesis primers of Rock2

9 免疫共沉淀

去除細胞培養液，用冷PBS 洗1 次。加RIPA 裂解液，溶解后，轉移到EP 管中用振蕩混勻，離心，上清轉移到新的EP 管。往上清分別加入6 ×his 抗體和HA 抗體，4 ℃旋轉混勻過夜，加入Protein A/G PLUS－Agarose，再混勻1 h 后使瓊脂糖(agarose)沉淀，去上清。往瓊脂糖加RIPA，振蕩混勻、離心、去上清。重復4 次洗凈。加3% SDS 緩沖液20 μL，－20 ℃保存備用。Western blotting 檢測Rock2 與Cdc25A 相互作用情況。

10 熒光共定位

細胞培養后進行爬片，4%多聚甲醛固定，0.5%triton 穿孔，10% 正常驢血清封閉非特異性結合位點，分別以羊抗Rock2 抗體、兔抗Cdc25A 抗體和羊抗Rock2 抗體+兔抗Cdc25A 抗體孵育過夜，PBS 沖洗，以上各組分別用FITC 標記的驢抗羊IgG 、TRITC標記的驢抗兔IgG 孵育1 h，PBS 沖洗，DAPI (0.1 mg/L)避光孵育30 min，PBS 沖洗后共聚焦顯微鏡觀察并照相。

11 統計學處理

結 果

1 Rock2 與Cdc25A 蛋白在肝癌組織中高表達且兩者呈正相關

通過檢測51 對肝癌及癌旁組織中Rock2 與Cdc25A 的蛋白表達，發現Rock2 與Cdc25A 在肝癌組織較癌旁組織呈現高表達，而且兩者呈正相關。其中，37 例肝癌組織中兩者呈現過表達(72.5%)，4例肝癌組織中兩者未見表達(7.8%)，單純Rock2 或Cdc25A 蛋白表達過高的有10 例(19.6%)，見圖1。

2 最佳shRock2 干擾質粒的篩選

將已構建的4 個shRock2 干擾質粒分別轉染到肝癌細胞Huh－7 中，Western blotting 檢測發現，Rock2 表達較對照組均降低，但shRock2－1 質粒效果更明顯，后續實驗將用該干擾質粒進行，見圖2。

3 Rock2 穩定低表達細胞中Cdc25A 蛋白表達降低

Western blotting 檢測發現，Rock2 表達降低后Cdc25A 蛋白的表達也隨之減少(P ＜0.05)，表明降低Rock2 的表達后對Cdc25A 可能起調節作用，見圖3。

4 轉染Rock2 突變質粒的特異性驗證

將已構建的針對Rock2 干擾序列的Rock2 突變質粒轉染到Rock2 穩定低表達的肝癌細胞株中，Western blotting 檢測發現，Rock2 與Cdc25A 的蛋白表達均“恢復”，而且肝癌細胞的增殖也明顯增加，見圖4。

Figure 1. The expression of Rock2 and Cdc25A in human hepatocellular carcinoma tissues (tumor，T)and adjacent liver tissues (nontumor，NT). A:representative Western blotting graphs;B，C:statistical analysis of Rock2 and Cdc25A expression，respectively;D:the relationship between Rock2 and Cdc25A expression. ±s.n=51. * P ＜0.05 vs T.圖1 Rock2 與Cdc25A 在肝癌組織及癌旁組織中的表達

5 降低Rock2 表達后Chk1 和Chk2 蛋白表達無明顯變化

Chk1 和Chk2 是Cdc25A 上游最主要的調節因子［7］。在Rock2 穩定低表達的肝癌細胞中，Western blotting 檢測表明Chk1 和Chk2 蛋白的表達無明顯變化，這表明Rock2 對Cdc25A 的調節并不依賴于Chk1/Chk2，見圖5。

6 Rock2 與Cdc25A 直接相互作用

Rock2 和Cdc25A 發生了免疫共沉淀作用，表明Rock2 直接作用于Cdc25A，見圖6。

7 Rock2 與Cdc25A 存在共定位

兩個蛋白之間的共定位通常發生在當熒光標記分子位置非常接近或者存在空間一致性時。激光共聚焦顯微鏡觀察結果表明，Rock2 與Cdc25A 之間存在共定位，見圖7。

討 論

原發性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國乃至世界上常見、且極具危害性的惡性腫瘤之一［8］。盡管近年來對其診斷、治療技術不斷進步，但肝癌的預后仍然較差。肝癌確切的發病機制尚未完全明了，肝癌的發生發展是癌基因的激活和抑癌基因的失活共同作用的結果［9］。因此，了解肝細胞癌變過程、原癌基因和腫瘤抑制基因具有重要意義。Rock2 是Rho/Rock 信號轉導通路的關鍵信號分子，近年研究發現，Rock2 在肝癌，膀胱癌，乳腺癌，睪丸癌等多種惡性腫瘤中呈現過高表達，而且在惡性腫瘤中其下游作用通路仍不十分清楚。遺傳信息的準確傳導對于細胞生存和癌癥預防是至關重要的。

Figure 2. The expression of Rock2 protein was decreased after transfection of shRock2 plasmids and the best shRock2 plasmid was selected. ±s.n=6. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs mock.圖2 轉染shRock2 干擾質粒后其蛋白變化明顯降低并篩選出shRock2 最佳干擾片段shRock2－1

Figure 3. The expression of Cdc25A protein was decreased in stable Rock2－knockdown Huh－7 and HepG2 cells. ±s.n=6. ＊＊P ＜0.01 vs mock.圖3 在Rock2 穩定低表達的肝癌細胞Huh－7 和HepG2 中Cdc25A 蛋白表達明顯降低

Figure 4. The specificity verification after transfection of Rock2－mutant plasmid.A:the wild－type and mutant Rock2 plasmids(bold letters indicate the silent mutations in the Rock2－mutant plasmid);B:the expression of Rock2 and Cdc25A after transfection with the Rock2－mutant plasmid(Rock2m)into shRock2－treated cells;C:the cell growth after transfection with Rock2m into shRock2－treated cells. ±s.n=3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs shRock2.圖4 轉染Rock2 突變質粒的特異性驗證

Figure 5. The expression of Chk1 and Chk2 proteins was not changed in stable Rock2－knockdown Huh－7 and HepG2 cells.圖5 在Rock2 穩定低表達的肝癌細胞Huh－7 和HepG2 中Chk1 和Chk2 的蛋白表達無明顯變化

Figure 6. Rock2 directly bound to Cdc25A. A:co－immunoprecipitation between 6 ×His－Rock2 and HA－Cdc25A in Huh－7 cells. HA－Cdc25A was detected in the immunoprecipitate when the anti－6 ×his antibody was used as the bait;6 ×his－Rock2 was detected in the immunoprecipitate when the anti－HA antibody was used as the bait. B:the endogenous Rock2 and Cdc25A directly bound to each other.圖6 Rock2 與Cdc25A 之間存在直接結合

G1/S 期檢查點能夠通過抑制DNA 復制的開始而阻止細胞進入S 期。細胞能否開始進行增殖，主要調控點在G1期，它決定了細胞能否通過G1期而進入S 期。Cdc25A 是控制G1/S 期調節途徑的重要檢查點蛋白，在轉導級聯激活作用中是一個重要的效應分子［4］。在人細胞中，Cdc25A 過表達會引起Cdk2/cyclin E 依賴激酶的早期激活，導致細胞過早進入S 期，細胞生長的失控，及可能引起惡性轉化［5］。相反，Cdc25A 表達的降低可以抑制Cdk2/cyclin E 的活性并阻止Cdc45 直接作用DNA 復制的起始［10－11］。Cdc25A 與一個復雜的調節系統相互作用，通過泛素蛋白酶體途徑的降解對于分裂細胞和應對DNA 損傷方面都是一個主要的控制途徑［12］。DNA 損傷時Cdc25A 的降解對于細胞周期阻滯是非常關鍵的。當細胞中不能降低Cdc25A 表達時會表現出檢查點阻滯功能的障礙，包括抗輻射的DNA 合成及Cdk2活性的升高。研究發現，Cdc25A在肝癌等多種惡性腫瘤中呈現高表達，而且Cdc25A 過高表達與侵襲及預后不良是密切相關的［5］。我們的前期研究發現，降低肝癌細胞中Rock2基因的表達，可以抑制肝癌細胞的增殖并使細胞周期阻滯于G1/S 期。Rock2 作為一個中介因子，了解其是否對Cdc25A 具有調節作用，對于全面分析Rock2 在S 期檢查點機制中的調節通路十分重要。

Figure 7. The co－localization of Rock2 and Cdc25A observed by confocal microscopy.圖7 共聚焦顯微鏡顯示Rock2 與Cdc25A 之間存在共定位

鑒于Rock2 與Cdc25A 蛋白在肝癌組織中呈現高表達，本研究通過收集51 例肝癌及癌旁組織標本，檢測發現Rock2 與Cdc25A 在肝癌組織中高表達而且兩者呈正相關。這表明Rock2 與Cdc25A 在肝癌的發生發展中可能存在密切聯系。鑒于Cdc25A是細胞周期G1/S 期的重要調節點，我們推測Rock2可能對Cdc25A 起調控作用。我們通過構建Rock2穩定低表達的肝癌細胞株Huh－7 和HepG2，檢測發現Cdc25A 蛋白的表達也隨之下降。進而，通過定點突變技術構建了Rock2 突變質粒“恢復”其表達，發現Cdc25A 蛋白明顯增加，肝癌細胞的增殖顯著增強。這表明利用RNA 干擾技術，Rock2 對Cdc25A調控作用存在特異性，消除了RNA 干擾的“脫靶效應”，證實Rock2 是通過調節Cdc25A 而發揮其下游的信號轉導作用。這可能為肝癌的發病機制提供一定的理論基礎。Chk1 和Chk2 在調控細胞周期與腫瘤的發生中起重要作用［13］，而且兩者是Cdc25A 上游最重要的直接調控檢查點蛋白［7］。鑒于它們的重要性，起初我們認為Rock2 通過影響Chk1 和Chk2蛋白的變化而對Cdc25A 起調節作用，但在Rock2 穩定低表達的細胞中并沒有發現Chk1 和Chk2 蛋白表達的變化。這些結果表明，Rock2 調節Cdc25A 不依賴于Chk1/Chk2，這可能是一條新的調節通路。既然Rock2 調節Cdc25A 不依賴于Chk1/Chk2，我們設想Rock2 與Cdc25A 之間是否存在直接的相互作用。免疫共沉淀實驗表明，Rock2 與Cdc25A 蛋白之間具有相互作用。這表明，Rock2 通過直接調節Cdc25A而發揮作用。通過共聚焦顯微鏡，更加直觀的免疫熒光實驗表明，Rock2 與Cdc25A 蛋白在位置上存在重疊及共定位。

Rock2 通過不依賴于Chk1/Chk2 的方式直接調節Cdc25A，這為Rock2 在肝癌中的調節機制研究提供重要線索，將為我們更加深入了解Rock2 在人肝細胞癌的發病機制及預后方面提供了廣闊的思路。

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