干擾素誘導蛋白p204對大鼠血管平滑肌細胞增殖的影響及其機制*

龍向淑， 吳 強， 宋 方

(貴州省人民醫院心血管內科，貴州貴陽550002)

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)是構成血管壁的重要成分，其增殖和凋亡失衡是動脈粥樣硬化、高血壓以及冠狀動脈介入治療術后再狹窄等血管增殖性疾病發病的主要病理生理機制。干擾素誘導蛋白p204(interferon－inducible protein p204)是干擾素(interferon，IFN)誘導蛋白p200家族(interferon－inducible protein 200 family，p200，IFI200)鼠類蛋白成員，其編碼基因Ifi204由Lengyel等［1］首先發現并成功克隆，其 mRNA約為2.2～2.3 kb，基因產物含640個氨基酸殘基，表觀分子量約72 kD。已有研究［2－4］表明，p204 可通過不同機制抑制多種細胞的增殖;且最近的研究顯示，p204可抑制大鼠VSMCs的增殖，p21可能參與了p204影響VSMCs增殖的下游調控［5］。生長因子在不同細胞通過不同的信號通路影響細胞增殖。本研究旨在進一步探討p204在抑制大鼠VSMCs增殖的過程中與相關細胞增殖信號通路之間可能存在的關系。

材料和方法

1 大鼠VSMCs的培養和實驗分組

純種SD大鼠(雌雄不拘)3只(購自第三軍醫大學實驗動物中心)，體重 120 ～140 g，按文獻［6］介紹的方法進行胸主動脈平滑肌細胞的培養、純化及鑒定。細胞培養及鑒定所用主要試劑DMEM高糖型細胞培養液、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自HyClone;α－SMA單克隆抗體(BM0002)、即用型SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒為武漢博士德公司產品。取4－6代細胞用于實驗。實驗分為4組，即空白陰性對照組(negative group，N)、非特異性 siRNA組(control siRNA group，C)、IFN － α 誘導組(IFN－ α induction group，IFN)和 Ifi204 siRNA轉染組(Ifi204 siRNA transfection group，siRNA)。干預所用藥物IFN－α購自北京三元基因工程有限公司。轉染試劑control siRNA －A(sc－36869)購自Santa Cruz;Ifi204 siRNA由寶生物工程(大連)有限公司合成，見表1;LipofectamineTM2000 reagent購自Invitrogen。各組干預6 h，繼續培養48 h收集細胞。

表1 siRNA及引物序列Table 1.The sequences of primers and siRNA

2 實時qRT－PCR法檢測mRNA表達

按TRNzol總RNA提取試劑盒(購自北京天根公司)說明操作提取細胞總RNA，按RT－PCR兩步法試劑盒(DRR047A，購自TaKaRa)說明書逆轉錄合成cDNA，然后按DRR420A試劑盒(購自TaKaRa)說明書操作進行實時qRT－PCR擴增。PCR擴增引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，見表1。按2－ΔΔCt法計算 p204 mRNA 的表達量。

3 Western blotting檢測蛋白表達

按文獻［7］介紹的方法進行蛋白樣品的制備、定量、分離、轉膜、印跡，從而測定特定蛋白的相對含量。使用的主要試劑p204抗體(sc－13367)購自Santa Cruz;Tubulin抗體(AT819)購自碧云天;Ras(ab108602)、p－Raf(ab78334)、p－ERK 44/42(ab47339)、p－Akt(ab78403)和 p－p38(ab32557)均購自Abcam。

4 MTT檢測細胞活力

收集對數生長期細胞，按3 000 cells/well接種于96孔板，各組干預方法同上述實驗。培養板用平板離心機4 000 r/min離心5 min，充分吸盡上清。每孔加入150 μL DMSO，置旋轉搖床上低速振蕩10 min，酶聯免疫儀490 nm波長檢測各孔吸光度A值。涉及的主要試劑四甲基偶氮唑鹽［3－(4，5－dimethylthiazol－2－yl)－2，5 －diphenyltetrazolium bromide，MTT］購自 Sigma。

5 流式細胞術檢測細胞周期

按細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒(C1052，購自碧云天公司)說明書操作收集細胞、染色后采用配套軟件進行細胞DNA含量分析。

6 統計學處理

結 果

1 p204在VSMCs的基礎表達和干預因素的影響

實時qRT－PCR和 Western blotting顯示，p204在N組存在一定豐度的基礎表達。與N組比較，IFN組的p204 mRNA與蛋白表達上調(P＜0.05)，siRNA組的p204 mRNA與蛋白表達下調(P＜0.05)，而C組與N組相比無顯著差異，見圖1～3及表2。

Figure 1.The curves of amplification and melting of p204 and GAPDH in real－time qRT－PCR.圖1 p204和GAPDH real－time qRT－PCR擴增曲線和熔解曲線

2 p204表達對VSMCs增殖的影響

與N組比較，IFN組 MTT的 A值降低(P＜0.05);G0/G1期細胞增多，S期細胞減少(P＜0.05);siRNA組MTT的A值增高(P＜0.05)，G0/G1期細胞減少，S期細胞增多(P＜0.05);而C組與N組的上述指標間差異無統計學意義，見表3。

3 p204表達對相關細胞增殖信號通路的影響

與N組比較，IFN組Ras蛋白表達和Raf及ERK的磷酸化水平下調(P＜0.05)，siRNA組Ras蛋白表達和Raf及ERK的磷酸化水平上調(P＜0.05)，而C組與N組的上述指標間差異無統計學意義，見圖2。4組間的p38 MAPK或Akt磷酸化水平的差異無統計學意義，見圖3。

表2 干預因素對p204 mRNA表達的影響Table 2.Effects of intervention factors on p204 mRNA expression(±s.n=3)

表2 干預因素對p204 mRNA表達的影響Table 2.Effects of intervention factors on p204 mRNA expression(±s.n=3)

N:negative group;C:control siRNA group;IFN:IFN－α induction group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.*P ＜0.05 vs negative group.

Group Ct ΔCt 2 －ΔΔCt p204 GAPDH N 19.15 ±0.23 16.78 ±0.36 2.37 1.00 C 19.33 ±0.56 16.83 ±0.26 2.50 0.91 IFN 17.22 ±0.38 17.08 ±0.09 0.14 4.69*siRNA 20.99 ±0.22 16.95 ±0.21 4.04 0.31*

表3 p204表達變化對VSMCs增殖及細胞周期的影響Table 3.Effects of p204 expression variation on cell cycle and proliferation of VSMCs(±s.n=3)

表3 p204表達變化對VSMCs增殖及細胞周期的影響Table 3.Effects of p204 expression variation on cell cycle and proliferation of VSMCs(±s.n=3)

N:negative group;C:control siRNA group;IFN:IFN－α induction group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.*P＜0.05 vs negative group.

N*

Figure 2.Effects of p204 expression variation on Ras/Raf/ERK signal pathway.±s.n=3.*P＜0.05 vs negative group.N:negative group;C:control siRNA group;IFN:IFN－α induction group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.圖2 p204表達變化對Ras/Raf/ERK信號通路的影響

Figure 3.Effects of p204 expression variation on phosphorylation of p38 and Akt.±s.n=3.*P＜0.05 vs negative group of p204 protein.N:negative group;C:control siRNA group;IFN:IFN－α induction group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.圖3 p204表達變化對p38及Akt磷酸化水平的影響

討 論

VSMCs過度增殖是血管增殖性疾病發病的主要環節，因此，研究如何采取有效措施抑制血管平滑肌細胞增殖、遷移以及表型轉化等是血管增殖性疾病領域研究的熱點。

IFN是一組具有抗病毒、抗增殖、影響細胞生長和分化、調節免疫應答等眾多生物學功能的活性細胞因子家族［8］。IFN與相應受體結合誘導一系列效應分子的產生而發揮其抗病毒、影響細胞增殖等作用［9］。p204是IFN誘導蛋白p200家族蛋白的鼠類成員。分子結構上，p204氨基端起始部含有一個由88個氨基酸殘基構成的DAPIN結構域，在其羧基端含有兩個相連的200A和200B。p204通過其特定的結構域介導IFN應答及與凋亡和炎癥信號通路蛋白(如 p53、pRb 和 Ras等)之間的結合［1］，發揮其調節細胞增殖、分化及遷移等生物學功能。本研究結果顯示，誘導p204 mRNA和蛋白表達增多，VSMCs增殖受到抑制，G0/G1期細胞增多，S期細胞減少;相反，抑制p204 mRNA和蛋白表達后，VSMCs增殖明顯，G0/G1期細胞減少，S期細胞增多。表明p204蛋白具有抑制VSMCs增殖及細胞周期G1/S轉換的作用。

細胞增殖是細胞外刺激信號作用于細胞膜或胞質受體，經細胞內信號傳遞使細胞周期改變為主的綜合性細胞行為，細胞內信號傳遞過程就成為細胞能否增殖的關鍵。絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)家族是細胞內信號蛋白網絡中重要的一員，主要介導細胞的發生、分化、增殖、凋亡及細胞間的功能同步等多種生理過程。目前至少鑒定出4種MAPK家族成員，分別為細胞外信號調節激酶(extracellular signal－regulated kinase，ERK)、c－Jun N端激酶/應激活化蛋白激酶、p38 MAPK 及 ERK5［10］。Ras和 Raf為 ERK 活化的上游信號蛋白，Ras在細胞外信號刺激下，轉化為激活型Ras，激活型Ras磷酸化活化Raf，活化的Raf再激活MEK，MEK經磷酸化最終激活 ERK，活化的ERK入核，啟動相應轉錄子的轉錄。Akt又稱蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，分子量約60 kD，Akt的活化亦可影響細胞的增殖、凋亡及衰老等生物學功能。p204可通過其200X結構域中的保守模序MF/LHATVAT/S與p53蛋白直接結合，調節p53介導的轉錄調控是其抑制細胞增殖的主要機制之一。p53可在轉錄水平促進p21表達，亦可抑制ras基因及myc基因協同作用引起的細胞增殖［11］。本研究結果顯示，誘導p204蛋白表達上調，抑制VSMCs增殖的同時，Ras蛋白表達減少，其下游信號蛋白Raf和ERK磷酸化水平亦隨之下降;反之，通過RNA干擾抑制p204表達，促進VSMCs增殖，則伴隨Ras蛋白表達增多，Ras信號通路下游信號蛋白Raf和ERK磷酸化水平亦升高。然而在上述過程中，對細胞增殖亦有重要影響的信號通路p38 MAPK及PI3K/Akt在VSMCs的磷酸化水平卻未出現明顯變化。故認為p204可能通過Ras/Raf/MEK/ERK信號通路抑制VSMCs的增殖，而與p38 MAPK和PI3K/Akt信號通路無關。

［1］宋 方，吳 強.干擾素誘導蛋白p204調節心肌分化的機制及應用前景［J］.中國細胞生物學學報，2011，33(1):59－64.

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［5］龍向淑，吳 強，宋 方.干擾素誘導蛋白p204表達變化對大鼠血管平滑肌細胞增殖及p21表達的影響［J］.中國病理生理雜志，2012，28(2):249－252.

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［9］Rebouillat D，Hovanessian AG.The human 2'，5' －oligoadenylate synthetase family:interferon－induced protein with unique enzymatic properties［J］.J Interferon Cytokine Res，1999，19(4):296 －308.

［10］梁 政，陳 燦，黃石安.p38絲裂原活化蛋白激酶與高血壓血管重構［J］.醫學綜述，2008，14(6):803－805.

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