大鼠膠原誘導性關節炎關節滑膜Treg/Th17平衡及TNF－α拮抗劑的影響*

陳瑞林， 陶 怡， 黃文輝， 呂志芬， 李 娟

(1南方醫科大學附屬南方醫院風濕科，廣東廣州510515;2廣州醫學院第二附屬醫院風濕科，廣東廣州510260)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關節軟骨和骨破壞為特征的慢性炎癥性自身免疫病［1］。這種破壞性損傷是由免疫反應和抗原非特異性炎癥過程引起的。RA的病因及發病機制尚不完全清楚，T細胞亞群異常在RA發病機制中起重要作用［2］。越來越多的證據表明，調節性T細胞(regulatory T-cells，Treg cells)和Th17細胞分化失衡可能在RA發病中占有重要地位［3］。但現有的大部分研究多關注RA外周血T細胞亞群失衡狀態，對于關節滑膜內Treg/Th17平衡，則很少報道。

本研究通過建立膠原誘導性關節炎(collageninduced arthritis，CIA)大鼠模型，研究Treg/Th17平衡在關節滑膜病變發生發展中的作用，并應用腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)拮抗劑腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白(TNFR-Fc)治療，探討TNFR-Fc對CIA關節滑膜Treg/Th17平衡的影響，以進一步闡明TNF-α拮抗劑治療的作用機制，并為更好地理解RA的發病機制、尋找更好的治療靶點提供理論依據。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 健康SPF級雌性Lewis大鼠30只，體重140～160 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 主要試劑 TNFR-Fc(由浙江海正藥業提供)，牛源性Ⅱ型膠原(Chondrex)，不完全弗氏佐劑(Chondrex)，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA 試劑盒(R＆D)，兔抗大鼠 CD4多克隆抗體(Abbiotec)，大鼠叉頭框P3蛋白(forkhead box P3 protein，Foxp3)單克隆抗體(Biolegend)，大鼠轉錄因子維甲酸受體相關孤兒受體γt(retinoic acid receptor-related orphan receptor γt，RORγt)單克隆抗體(Abcam)，FITC結合的抗兔IgG和rhodamine結合的抗鼠IgG(Sigma)。

2 方法

2.1 CIA大鼠模型的建立 按文獻［4］報道的建立CIA大鼠模型，簡述如下:將30只Lewis大鼠隨機分成正常對照組、CIA組、TNFR-Fc治療組。將牛源性Ⅱ型膠原和等體積不完全弗氏佐劑混合、乳化后，CIA組和TNFR-Fc治療組大鼠于尾根部及背部多點皮下注射0.4 mL，正常對照組大鼠皮下注射等量生理鹽水。7 d后加強免疫，第13 d TNFR-Fc治療組開始采用10 mg/kg TNFR-Fc腹腔注射，隔天1次;CIA組則予等量生理鹽水腹腔注射，隔天1次。

2.2 模型的鑒定及評估

2.2.1 關節炎的分級評估 每周1次評估大鼠關節腫脹和紅斑的出現情況。根據Wood法對關節炎的嚴重程度進行分級評估，評定依據為關節紅腫程度和范圍以及關節腫大和變性情況。0:正常;1:紅腫;2:腫脹;3:足趾畸形;4:踝部畸形，不能負重。每側關節最高4分，每只大鼠最高評分為16分。關節炎指數(arthritis index，AI)=四肢關節評分之和。

2.2.2 關節滑膜組織病理形態學檢查 造模后35 d處死大鼠，取后踝關節，置于10%甲醛溶液中固定24 h，經脫鈣、脫水、透明、包埋等處理制成石蠟塊，室溫保存。切片，甲苯胺藍、HE染色，光學顯微鏡下觀察病理組織學變化。

2.2.3 血漿TNF-α濃度檢測 心臟穿刺法取大鼠外周血2 mL，置于EDTA抗凝管中，離心，取上層血漿，-80℃保存;大鼠TNF-α ELISA試劑盒檢測各組大鼠血漿TNF-α濃度，操作步驟按說明書進行。

2.3 滑膜Foxp3和RORγt蛋白表達 應用免疫熒光雙標染色法檢測。石蠟切片脫蠟，2%正常羊血清工作液封閉非特異性結合位點，37℃濕盒內孵育60 min;離心去血清，予CD4多克隆抗體(1∶1 000)、Foxp3單克隆抗體/RORγt單克隆抗體(1∶500)依序孵育。磷酸緩沖液(PBS)沖洗后，切片予1∶50稀釋的FITC標記的抗兔IgG和1∶50稀釋的rhodamine標記的抗鼠IgG孵育。對照切片予正常兔血清和PBS來代替Ⅰ抗孵育。PBS沖洗后，AEC水性封片劑封片，在共聚焦顯微鏡(Leica SP2)下觀察，激發波長分別為488 nm和543 nm。細胞計數采用在400×鏡下計數形態完整的陽性細胞，6張切片/每只動物，每張切片鏡下統計200個細胞中的陽性細胞數量。

3 統計學處理

用SPSS 15.0統計軟件進行統計分析，數據用均數±標準差(±s)表示，計量資料組間比較根據數據分布類型分別采用單因素方差分析和秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 模型的鑒定及評價

1.1 大鼠關節炎足爪評分 造模后CIA組大鼠平均第18 d出現明顯關節炎癥狀，后足首先出現紅腫，然后前足紅腫，隨時間延長，于21 d左右達到高峰，嚴重者不能負重，關節活動障礙，提示大鼠CIA模型建立成功。TNFR-Fc治療組大鼠出現關節炎時間與模型組大致相似，高峰時間延遲至第28 d，且關節炎程度較CIA組顯著減輕(P＜0.01)，見圖1。對照組關節無異常改變。

Figure 1.The arthritis index of CIA rats.±s.n=6.＊＊P＜0.01 vs CIA.圖1 CIA組大鼠和TNFR－Fc治療組大鼠的關節炎指數

1.2 關節組織病理學檢查 病理學觀察結果顯示，正常大鼠滑膜組織細胞排列規則，未見淋巴細胞及漿細胞的浸潤及軟骨染色缺失;CIA組大鼠關節滑膜組織呈重度增生，滑膜層變厚，排列紊亂，大量淋巴細胞、中性粒細胞和單核細胞浸潤，軟骨重度缺失;TNFR-Fc治療組HE染色滑膜增生及炎癥細胞浸潤較CIA組輕，見圖2。

1.3 血漿TNF-α濃度 ELISA結果顯示CIA組TNF-α較正常對照組及TNFR-Fc治療組顯著升高［CIA 組(713.33 ±145.83)ng/L vs TNFR-Fc治療組(67.62 ± 20.05)ng/L，正常對照組(24.86 ±3.12)ng/L］(P ＜0.01)，TNFR-Fc 治療組與正常對照組間差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖3。

Figure 2.The synovial pathological characteristic from various groups(HE staining，×400).圖2 各組大鼠關節滑膜病理學HE染色

Figure 3.Plasma TNF-α level in rats from various groups.±s.n=6.＊＊P ＜ 0.01 vs control and TNFR-Fc treatment.圖3 三組大鼠血漿TNF－α水平

2 滑膜Foxp3和ROR－γt表達的比較

CD4被FITC標記為綠色熒光，Foxp3/RORγt被rhodamine標記為紅色熒光，共表達的部分呈黃色熒光。結果顯示Treg和Th17細胞主要分布在滑膜襯里細胞層及血管周圍;CIA組的CD4+Foxp3+Treg/CD4+細胞比例與正常對照組無明顯差異(23.12%±4.93%vs 24.66% ± 5.82%，n=6，P ＞ 0.05)，而TNFR-Fc治療組則升高明顯(33.07% ±5.14%);CIA組CD4+RORγt+Th17/CD4+細胞比例顯著增高(9.74% ± 2.23%vs 正常對照組 1.00% ± 0.59%，TNFR-Fc 治療組 5.63% ± 1.76%，n=6，P ＜0.01)，見圖 4、5。

討 論

RA是一種以慢性侵蝕性周圍關節炎為主要表現的自身免疫性疾病。CIA由Trentham等［5］于1977年創立，用Ⅱ型膠原免疫大鼠誘導多關節炎癥，由于其引起關節的癥狀和病理與 RA相似(滑膜增生、細胞浸潤、軟骨侵蝕、骨吸收和重塑)，被認為是人類RA的經典動物模型，較廣泛地用于RA機制的研究以及RA藥物干預治療研究［6］。Lewis大鼠是制造CIA模型鼠的高度敏感鼠。本研究采用牛源性Ⅱ型膠原配合不完全弗氏佐劑成功誘導了CIA模型的發生。

既往認為 RA是Th1占優勢的自身免疫病，但越來越多的研究結果提示Th1細胞可能在RA發病中并非占有主導地位［7-8］。Treg和Th17細胞的發現，彌補了Th1/Th2介導效應機制的不足。Treg和Th17細胞雖同屬于CD4+T細胞，但生物學作用完全相反。IL-6和TGF-β等細胞因子作為關鍵因素決定著免疫應答是Treg占主導地位，還是Th17占主導地位:在穩定狀態或無炎癥損傷情況下，機體免疫系統產生的TGF-β抑制著效應T細胞的增殖，誘導初始T細胞向Treg分化;當存在炎癥時，急性期蛋白IL-6大量產生，抑制了Treg的增殖，誘導初始T細胞向Th17分化［9］。對RA患者和動物模型的研究均表明Treg細胞在RA發病中有重要作用。在一些研究中已經證實，早期RA患者的外周血中的CD4+CD25+Treg的數量比健康對照低［10-11］，可能正是因為這種細胞數量上的缺失，導致了免疫抑制功能的低下，給疾病的發生發展創造了條件。Lawson等［11］發現治療后病情控制良好的RA患者Treg水平與正常人則無明顯差別，說明RA病程及治療情況對Treg水平確實存在影響。Th17細胞主要分泌IL-17，還能分泌TNF-α、IL-21、IL-22和 IL-6;此外 IL-17可以和其它細胞因子如TNF-α、IL-1β、IFN-γ等相互作用產生協同效應。研究發現RA患者關節滑液中 IL-17 的含量明顯升高［7］;動物實驗［12］初步結果顯示，在關節炎早期階段應用中和性抗 IL-17抗體可以顯著減輕關節炎的嚴重程度，即使在關節炎的晚期階段抗 IL-17抗體仍然可以顯著減緩病程的發展。最近有研究報道［13］，隨著疾病活動性的增加，RA患者外周血CD4+T細胞中Th17細胞的比率增加而Foxp3+CD4+CD25+Treg細胞比率降低，導致Th17/Treg細胞比例失衡，并且平衡向Th17細胞一方偏移，提示RA患者體內的免疫抑制效應減弱而免疫炎性效應增強，二者的共同作用可誘導外周血T細胞亞群的紊亂以及外周免疫耐受的破壞，進而促進疾病的發生發展。

Figure 4.CD4-Foxp3 lymphocytes in synovium stained by double immunofluorescent labeling and observed by confocal microscopy(×400).Arrows pointed out CD4+Foxp3+Treg cells.圖4 激光共聚焦顯微鏡下觀察免疫熒光雙染的滑膜中CD4－Foxp3淋巴細胞

Figure 5.CD4-RORγt lymphocytes in synovium stained by double immunofluorescent labeling and observed by confocal microscopy(×400).Arrows pointed out CD4+RORγt+Th17 cells.圖5 激光共聚焦顯微鏡下觀察免疫熒光雙染的滑膜中CD4－RORγt淋巴細胞

本研究采用激光共聚焦顯微鏡觀察CIA大鼠發病高峰期關節滑膜的Treg和Th17細胞，發現 CIA大鼠滑膜增生明顯，Treg和Th17細胞主要分布在滑膜襯里細胞層及血管周圍;Th17細胞表達水平比正常大鼠明顯增多，而Treg細胞則與正常組相比無明顯差異，提示CIA大鼠病變關節滑膜存在Treg/Th17分化失衡，可能是由于Treg的功能受抑，Th17細胞誘導分化，而使得Th17細胞占主導地位。因此抑制Th17細胞分化，促進Treg細胞生成，誘導免疫耐受，重新建立體內免疫穩態，可能是治療RA等自身免疫性疾病的新思路。

近年來將TNF-α拮抗劑用于治療活動性RA獲得成功，臨床試驗表明抗TNF-α治療不但能夠改善RA患者的癥狀和提高功能，而且可以有效控制病情的進展，這是RA臨床治療的一個飛躍［14］。但是TNF-α拮抗劑治療的作用機制還不完全清楚。我們之前的研究發現，抗TNF-α治療的機制不僅僅是阻斷TNF-α的促炎作用，還可減少關節滑膜及軟骨骨橋蛋白的表達［4］。而 TNF-α拮抗劑對CIA關節滑膜Treg/Th17分化的影響，未見系統報道。目前批準上市的TNF-α拮抗劑主要有3種，分別為TNFR-Fc(腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白)、Infliximab(TNF-α的人鼠嵌合、含25%鼠蛋白和75%人蛋白的IgG1單克隆抗體)和Adalimumab(重組全人源TNF-α IgG1單克隆抗體)。本研究使用TNFR-Fc治療CIA模型鼠后，TNFR-Fc治療組血漿TNF-α值較CIA組明顯降低，病理組織學評分亦顯示TNFR-Fc治療組關節及軟骨的病變較CIA組明顯輕。故TNFR-Fc對RA有較好的治療作用，可顯著減輕滑膜炎癥和抑制滑膜增生，與文獻報道結果一致。我們進一步觀察TNFR-Fc治療對關節滑膜Treg/Th17的影響，結果顯示TNFR-Fc治療組的Treg細胞顯著高于CIA組和正常對照組;而Th17細胞則比CIA組明顯減少，但高于正常對照組。有體外研究［15］結果認為TNFR-Fc并不能阻抑Th17細胞的誘導或恢復Treg細胞的生成，同時進行的CIA動物實驗結果顯示TNFR-Fc對外周Th17和Treg細胞沒有影響，認為TNFR-Fc對關節炎的治療作用與誘導Treg細胞無關。但與此相矛盾的研究報道比比皆是，如Ehrenstein等［16］報道的RA存在Treg細胞功能受損，抗TNF-α治療不但使其免疫抑制功能恢復，還使其數量增加;Ricciardelli等［17］研究發現，接受TNF-α拮抗劑治療的Crohn’s病患者與接受傳統治療方法的患者相比較，其腸道黏膜中的Foxp3+的細胞比例和Foxp3 mRNA的表達均顯著升高，提示抗TNF-α治療可能影響黏膜調節性T細胞的活化和擴增;Notley等［18］進行的CIA動物實驗，采用流式細胞術檢測Th17細胞，結果則顯示TNFR-Fc導致外周血Th17細胞擴增，但關節滑液的Th17細胞卻明顯減少，推測可能是因為TNFR-Fc抑制Th17細胞聚集于關節。我們的研究結果與之相似，不同的是我們同時檢測關節滑膜Treg/Th17細胞的變化，而且采用激光共聚焦顯微鏡更直觀地觀察病變關節滑膜Treg/Th17細胞的定位，排除自發熒光、成團細胞或細胞碎片的干擾;但缺點是觀察細胞數目有限，存在主觀因素影響。我們的研究結果提示CIA大鼠關節滑膜的Treg細胞數量沒有明顯減少，但可能存在功能受抑，Th17細胞增多，病變關節滑膜存在Treg/Th17分化失衡;TNFR-Fc可能通過抑制關節滑膜Th17細胞分化，誘導Treg細胞生成/聚集，使得病變關節的Treg/Th17平衡得以恢復，從而打破炎性瀑布的環路，恢復機體免疫耐受功能而緩解病情。

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