針刺對創傷性腦損傷大鼠腦組織EGF和bFGF表達的影響*

張毅敏， 唐純志， 程少冰， 陳愛連， 張玉卿

(1暨南大學醫學院中醫系，廣東廣州510632;2廣州中醫藥大學針灸推拿學院，廣東廣州510010)

創傷性顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是一個世界性的社會醫學問題，發生率為1‰［1－2］，已成為發達國家青少年傷病致死的首位病因。目前利用神經干細胞修復顱腦損傷已成為國內外生物及醫學研究的熱點［3］。內源性神經干細胞具有來源穩定可靠、無倫理道德問題、無免疫排斥反應、無致瘤性等優勢，因此，尋找積極干預措施，充分調動內源性神經干細胞治療神經系統疾病已成為當前新的研究熱點［4］。神經干細胞的增殖分化受多種生長因子的調控，其中表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是對神經干細胞的生長和增殖起關鍵作用的生長因子。大量臨床資料表明，針刺對腦損傷患者催醒及神經功能恢復有顯著療效［5］，故本研究采用腦挫傷大鼠動物模型，觀察針刺對腦損傷后相關生長因子EGF和bFGF的影響，探討針刺促進神經再生、治療腦損傷的可能作用機制。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠共30只，體重(280±30)g，鼠齡42 d，由廣州中醫藥大學動物實驗中心提供，動物合格證號為0067955。本實驗在廣州中醫藥大學清潔級動物實驗室完成。

1.2 試劑與藥物 EGF和bFGF免疫組化檢測試劑盒(德國寶靈曼公司產品，購自武漢博士德生物工程有限公司)。針具為“華佗牌”一次性26號、1寸針灸針。

1.3 儀器 RM2025切片機(Leica)和EG1140H包埋機。Olympus BX50F－3雙目顯微鏡(附件自動照相裝置Nikon E990)。計算機圖像分析系統(GM－2000B生物醫學圖像分析系統，北京航天航空大學產品)。

2 方法

2.1 腦損傷模型建立 動物隨機分為3組:A組為假手術組，B組為模型組，C組為針刺組，每組10只。大鼠稱重后腹腔注射10 g/L戊巴比妥鈉(30 mg/kg)，麻醉成功后參照Feeney自由落體沖擊造模法［6］，沿顱骨正中線縱形切開頭皮，分離至顱骨，于矢狀縫左旁2 mm，冠狀縫后2 mm處，用牙科鉆鉆開顱骨，以此為中心，用蚊式血管鉗咬開直徑約4 mm圓形骨窗，深度至硬腦膜，保持硬腦膜完整。B、C組用致傷力度為25 g小錘從25 cm高度自由落下，打擊置于硬腦膜上的直徑為3 mm的圓柱體，造成左頂葉大腦皮質局限性腦挫裂傷，然后將動物縫合頭皮。A組鉆孔后不打擊，直接縫合頭皮。

針刺組造模后24 h內開始治療。針刺組穴位:百會、人中、風府透啞門和合谷。將針刺入穴位2 mm，采用捻轉平補平瀉手法，每穴操作2 min。每天治療1次，共治療7次。假手術組及模型組不做治療。各組在相同條件下喂養。治療結束當天取材，大鼠用10%的水合氯醛麻醉，斷頭取腦，4%中性多聚甲醛液固定，常規脫水，石蠟包埋，沿挫傷灶中心作冠狀切片，片厚4 μm。

2.2 免疫組化法檢測EGF和bFGF 各組實驗大鼠腦組織切片經純二甲苯脫蠟2次，每次6 min;梯度乙醇脫二甲苯各2 min;自來水漂洗、PBS漂洗各3次，每次2 min，加3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶，室溫下作用10 min;切片放入已沸騰的檸檬酸修復液中，繼續加熱至溶液冒小氣泡但不沸騰為度，保持10 min;停止加熱，冷卻至室溫約25 min，流水沖洗，PBS液洗2次，擦干切片組織周圍表面水分劃隔離圈;加入5%BSA封閉液，室溫下作用20 min;吸去血清，不洗分別直接滴加入對應的(濃度1∶100)稀釋的第Ⅰ抗體兔抗(EGF、bFGF)100 μL/片，取1張切片滴加PBS作為陰性對照，37℃恒溫箱內1 h;PBS沖洗，3 min×3次，滴加羊抗兔生物素化Ⅱ抗，100 μL/片37 ℃恒溫箱內 20 min;PBS沖洗，3 min×3次，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉親合素100 μL/片，37℃恒溫箱內20 min;PBS洗后滴加入DAB顯色液100 μL/片，顯色3～5 min;蘇木素淺復染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片、分析結果。注意:操作過程中組織必須保持在濕潤狀態，不能干燥;所加試劑以完全覆蓋組織為度。

免疫組織化學染色結果判斷:由病理專科醫生在未知實驗分組情況下對所有標本進行分析。在10×20倍光鏡下隨機觀察每一組動物同一部位切片，每張切片選擇5個不重復視野進行觀察，并采用全自動圖像分析系統測出每張切片內腦組織EGF和bFGF的染色平均吸光度和染色面積率。陽性物質在胞漿(膜上)內呈棕黃色細顆粒狀，細胞核為淺藍色;陰性對照僅細胞核為淺藍色。

3 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件進行單因素方差分析。組間比較:方差齊性時采用LSD檢驗，方差不齊時采用T3法檢驗。數據以均數±標準差(±s)表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 針刺對腦挫傷大鼠腦組織EGF表達的影響

模型組大鼠EGF平均吸光度值與陽性面積率較假手術組明顯降低(P＜0.01);針刺組EGF平均吸光度值與陽性面積率較模型組明顯升高(P＜0.01)，見圖1、表1。

2 針刺對腦挫傷大鼠腦組織bFGF表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠bFGF平均吸光度值升高((P＜0.01)，但陽性面積率無顯著差異(P ＞0.05);與模型組比較，針刺組bFGF平均吸光度值和陽性面積率均明顯升高(P ＜0.01)，見圖2、表2。

Figure 1.Expression of EGF protein in the cerebral cortex of rats in different groups(SABC staining，×200).A:sham －operated group;B:model group;C:acupuncture group.圖1 各組大鼠大腦皮質EGF蛋白表達

表1 針刺對腦損傷大鼠腦組織EGF表達的影響Table 1.Effect of acupuncture on EGF expression in brain tissues of rats with traumatic brain injury(±s.n=10)

表1 針刺對腦損傷大鼠腦組織EGF表達的影響Table 1.Effect of acupuncture on EGF expression in brain tissues of rats with traumatic brain injury(±s.n=10)

＊＊P ＜0.01 vs sham － operated group;▲▲P ＜0.01 vs model group.

Group Absorbance Rate of positive area Sham － operated 0.69 ±0.05 0.43 ±0.03 Model 0.34 ±0.31＊＊ 0.18 ±0.16＊＊Acupuncture 0.53 ±0.36＊＊▲▲ 0.29 ±0.22＊＊▲▲

表2 針刺對腦損傷大鼠腦組織bFGF表達的影響Table 2.Effect of acupuncture on bFGF expression in brain tissues of rats with traumatic brain injury(±s.n=10)

表2 針刺對腦損傷大鼠腦組織bFGF表達的影響Table 2.Effect of acupuncture on bFGF expression in brain tissues of rats with traumatic brain injury(±s.n=10)

＊＊P ＜0.01 vs sham － operated group;▲▲P ＜0.01 vs model group.

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Figure 2.Expression of bFGF protein in the cerebral cortex of rats in different groups(SABC staining，×200).A:sham －operated group;B:model group;C:acupuncture group.圖2 各組大鼠大腦皮質bFGF蛋白表達

討 論

神經干細胞(neural stem cells，NSCs)的增殖分化受多種生長因子的調控［7］，目前普遍認為EGF和bFGF等絲裂原信號在NSCs的生長和增殖起關鍵作用，均可維持NSCs的自我更新能力，其它細胞因子起協同作用［8］。bFGF是能夠促進NSCs或神經前體細胞有絲分裂并具有神經營養作用的活性多肽，除通過FGFR－1傳遞有絲分裂信號外還通過其它受體起作用［9］。體外研究表明:EGF和 bFGF可以使NSCs在體外呈神經球樣生長，并促進細胞分化，使未分化的神經細胞向著生成神經元的方向分化。但EGF與bFGF在NSCs增殖和分化中的作用存在一定差異:bFGF在胚胎發育早期具有維持神經前體細胞生存和促進其增殖的作用，而EGF在發育晚期能促進神經前體細胞增殖和分化;FGF－2主要促使向神經元轉化，而EGF誘導NSCs分化為膠質細胞［10］。研究者在EGF灌注后立即檢測擴增細胞群的特征，發現95%以上的細胞呈EGF受體陽性和神經上皮干細胞蛋白(nestin)陽性。停止EGF注射7周后，一部分細胞分化成為新的神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞［11］。正常腦組織有基礎性bFGF表達，腦損傷后bFGF表達水平上調。Neary等［12］研究發現，bFGFmRNA表達在24 h時增強，3 d時達高峰，并持續到7 d。也有研究發現，三七總皂苷能促進腦內bFGF合成及分泌，刺激神經干細胞的增殖，使缺血再灌注大鼠的nestin表達上調，從而發揮腦保護作用［13］。

本研究結果顯示，模型組損傷區腦組織EGF平均吸光度與陽性面積率均明顯降低，而bFGF平均吸光度值升高，這與以往的研究結果一致［12］，表明造模是成功的。針刺組EGF、bFGF均較模型組明顯升高(P＜0.01)，表明針刺能上調神經再生相關生長因子EGF和bFGF的表達，加速損傷腦組織修復。我們的前期研究結論“針刺可促進神經干細胞的增殖與分化”及“針刺可縮小腦損傷面積”均證明了這一點［14］。

綜上所述，針刺可促進神經再生相關生長因子EGF和bFGF的表達，這可能是針刺促進神經再生和功能恢復、治療顱腦損傷的機制之一。

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