人骨髓胚胎樣干細胞向多核肌纖維誘導分化的研究*

龐榮清， 張永云，2△， 阮光萍， 朱向情，2， 何 潔， 趙 晶， 王利民， 潘興華， 張 成

(1成都軍區昆明總醫院干細胞與組織器官工程研究中心，云南昆明650032;2云南農業大學農科專業基礎實驗教學示范中心，云南昆明650201;3中山大學附屬第一醫院神經內科，廣東廣州510080)

肌營養不良癥等肌病的治療目前尚無有效手段。干細胞技術的發展雖然為此帶來了新的希望，但療效尚需進一步提高。其中，種子細胞的選擇是影響干細胞治療效果的關鍵因素之一［1］。

研究證實:成體骨髓中存在表達胚胎干細胞抗原標志的干細胞，如多潛能成體祖細胞(multipotential adult progenitor cells)［2］、骨髓來源成體多潛能誘導細胞(bone marrow－derived adult multilineage inducile cells)［3］和很小胚胎樣干細胞(very small embryonic － like stem cells，VSELs)［4］，在早期的文獻中這類細胞的名稱不同，近年來的文獻［5－7］中逐漸使用胚胎樣干細胞(embryonic－like stem cells，ELSCs)的命名。本研究根據Battula等［8］的方法，從骨髓中分離 ELSCs，然后開展了體外成肌分化實驗研究，旨在為探索理想的肌病治療種子細胞提供實驗依據。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

材料和方法

1 主要試劑

成肌分化誘導試劑盒(SKGM－2 Kit，Lot No.CC－3245)購自 Lonza;明膠和2－mercaptoethanol購自 Sigma;DMEM/F12購自HyClone;Knockout－DMEM、血清替代物(serum replacement，SR)、glutamine、非必需氨基酸(non － essential amino acids，NEAA)、新生牛血清(newborn cattle serum，NCS)、FITC －goat－anti－rabbit IgG、FITC －rabbit－anti－goat IgG 和4＇，6－二脒基 －2－苯基吲哚(4＇，6－diamidino－2－phenylindole，DAPI)均購自Invitrogen;堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)購自 Cell Systems;免疫染色用Ⅰ抗［rabbit－anti－human Oct－4、Nanog－3、MyoD，goat－anti－human Sox－2和mouse－anti－human成肌素(myogenin)、肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)］購自Santa Cruz;Ⅱ抗HRP－conjugated rabbit/mouse antibody購自Gene;所用引物(表1)和RT－PCR試劑盒為北京全式金生物技術有限公司產品。

2 主要方法

2.1 ELSCs和間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的分離培養 參照Battula等［8］的方法，密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞，用無血清培養基重懸單個核細胞并轉移到事先用明膠包被過的培養瓶中于37℃、5%CO2培養箱內靜置培養以分離擴增ELSCs。無血清培養基是添加了20%SR、2 mmol/L L － glutamine、1%NEAA、0.1 mmol/L 2 － mercaptoethanol和5 μg/L bFGF的Knockout－DMEM培養液。培養瓶的包被:每個培養瓶中加入5 mL 0.1%明膠溶液室溫條件下靜置30 min，然后吸棄明膠溶液于室溫條件下風干即可。作為對照，用含血清培養基重懸單個核細胞并轉移到未包被的培養瓶中于37℃、5%CO2培養箱內靜置培養以分離擴增MSCs。含血清培養基為含10%NCS的DMEM/F12培養液。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況并拍照。每4 d換液，到細胞生長至80%融合狀態時，用trypsin/EDTA消化傳代細胞。取第2代細胞作細胞爬片行Oct－4、Nanog－3和Sox－2的免疫熒光染色。

2.2 體外成肌分化誘導實驗 消化收集生長良好的第4代ELSCs，用無血清培養基重懸細胞，6孔板中事先放置明膠包被的蓋玻片，按照2×104cells/well接種細胞到蓋玻片上于37℃、5%CO2條件下培養24 h使其貼壁后，吸棄無血清培養基，換為試劑盒提供的成肌分化誘導培養液繼續誘導培養。按照相應的培養方案和細胞密度，消化收集生長良好的第4代MSCs，用含血清培養基使其貼壁生長后，吸棄含血清培養基，換為上述成肌分化誘導培養液誘導培養。適時換液，取細胞爬片，用4%多聚甲醛固定后，免疫染色檢測肌細胞抗原標志MHC、MyoD和myogenin的表達。采用相同的方法，第4代ELSCs和MSCs培養在細胞培養瓶中，細胞貼壁后，換為上述成肌分化誘導培養液誘導培養，消化收集細胞作RT－PCR分析。為了比較2種細胞的成肌分化效率，根據方法［9］計算樣品的成肌分化效率，每個細胞爬片計數6個視野。計算公式:成肌分化效率=MHC陽性肌纖維數/計數的總細胞數目。

2.3 免疫細胞化學染色法 將各組細胞用PBS清洗之后，用4%甲醛固定10 min，再用0.5%Triton X－100破膜處理10 min。然后用PBS清洗3遍，加入封閉液室溫條件下作用10 min，免疫熒光染色細胞滴加Ⅰ抗(rabbit－anti－human Oct－4、Nanog－3和 goat－anti－human Sox－2)，4 ℃避光孵育10 h，PBS漂洗1次以去除未結合的Ⅰ抗，滴加Ⅱ抗(FITC－goat－anti－rabbit IgG或 FITC－rabbit－anti－goat IgG)于室溫條件下避光孵育30 min，再滴加DAPI于室溫條件下避光孵育5 min，PBS漂洗去除未結合的Ⅱ抗和DAPI。PBS替代Ⅰ抗染色作為陰性對照。熒光顯微鏡下觀察拍照。非免疫熒光染色細胞滴加Ⅰ抗(rabbit－anti－human MyoD和mouse－anti－human myogenin、MHC)，4 ℃孵育10 h，PBS漂洗1次以去除未結合的Ⅰ抗，滴加Ⅱ抗 HRP－conjugated rabbit/mouse antibody于室溫條件下孵育30 min，PBS漂洗去除未結合的Ⅱ抗。PBS替代Ⅰ抗染色作為陰性對照。生物顯微鏡下觀察并用 ×10或 ×20攝取。每組獨立的實驗都會采集超過30個區域的細胞。

2.4 RT－PCR 采用Trizol提取總RNA，分光光度法測定計算提取的總RNA含量及濃度，取5 μg RNA用于反轉錄合成互補DNA。參照RT－PCR試劑盒實驗操作說明檢測myogenin、MHC和MyoD mRNA的表達。擴增條件為:50℃逆轉錄30 min，94 ℃ 初始化 4 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，45個循環，72℃ 7 min。GAPDH用作內參照控制。不加cDNA的反應設為對照。取擴增產物15 μL，加上樣緩沖液2.0 μL，在1%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠圖像成像系統拍照。

Figure 1.Morphological characterization of ELSCs and MSCs under light microscope(×40).A:primary ELSCs appeared small，morphologically slenderer and of homogeneous shape;B:primary MSCs showed different morphologies including spindle－shaped，epithelioid，polygonal or round shape.圖1 ELSCs和MSCs的形態特征

Figure 2.Expression of multipotential markers ELSCs and MSCs.A:weak expression of Oct－ 4 in ELSCs;A1:magnification of A;B:weak expression of Nanog－3 in ELSCs;B1:magnification of B;C:weak expression of Sox－2 in ELSCs;C1:magnification of C;D:no expression of Oct－4 in MSCs;E:no expression of Nanog－3 in MSCs;F:no expression of Sox － 2 in MSCs.A，B，C，D，E，F:× 100;A1，B1，C1:×200.圖2 多潛能抗原標志在ELSCs和MSCs的表達

3 統計學處理

用SPSS 10.0統計軟件進行分析，數據用均數±標準差(±s)表示，均數比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 ELSCs和MSCs的分離擴增

采用無血清培養基(含20%SR、2 mmol/L L－glutamine、1%NEAA、0.1 mmol/L 2 －mercaptoethanol和5 μg/L bFGF 的knockout－DMEM培養液)在明膠包被過的培養瓶中培養骨髓單個核細胞可以分離到ELSCs。采用有血清培養基(含10%NCS的DMEM/F12培養液)在未包被過的培養瓶中培養相同的骨髓單個核細胞可以分離到MSCs。在倒置相差顯微鏡下可見這2種細胞形態存在明顯差別。ELSCs體積較小、形態纖細均一，見圖1A。MSCs體積較大，常包括紡錘形、多邊性和圓形等多種細胞形態，見圖1B，傳代后變得均一。免疫熒光染色顯示:采用無血清培養基擴增的第2代ELSCs能檢測到多潛能抗原標志Oct－4、Nanog－3和Sox－2的微弱表達，見圖2A、A1、B、B1、C、C1，而采用經典方法擴增的 MSCs沒有檢測到這些抗原標志的表達，見圖2D、E、F。

2 體外成肌誘導分化

由Lonza公司生產的成肌分化誘導培養液由100 mL skeletal muscle growth medium、10 mL fetal bovine serum、2 mL glutamine、0.1 mL重組人表皮生長因子(recombinant human epidermal growth factor，rhEGF)、0.1 mL dexamethasone 和 0.1 mL gentamicin sulfate amphotericin－B組成。貼壁生長的第4代ELSCs和MSCs在此誘導液中培養3 d即可檢測到少量MHC蛋白陽性表達，10 d左右檢測到大量MHC陽性細胞，第12 d后MHC陽性細胞減少。提示:10 d是最佳誘導培養時間。免疫染色結果顯示:誘導培養10 d的第4代ELSCs和MSCs均可檢測到大量MHC和mygenin陽性的多核肌纖維，見圖3，形態特征非常典型。RT－PCR分析結果證實:誘導10 d的ELSCs和MSCs表達了MHC和myogenin mRNA，見圖4。但沒有檢測到MyoD在蛋白和mRNA水平的表達。作為對照，不在成肌分化誘導培養基中培養的ELSCs和MSCs都檢測不到肌細胞特異性標志抗原MHC、myogenin和MyoD的表達。統計分析結果顯示:誘導培養10 d的ELSCs的成肌分化率為(25.7±4.1)%，明顯高于MSCs(15.8±7.6)%，差異顯著(P＜0.05)。

Figure 3.Expression of muscle－specific markers in ELSCs and in MSCs cultured in myogenic differentiation medium for 10 d.A:expression of MHC in ELSCs;B:expression of MHC in MSCs;C:three nucleated fibers;D:multinucleated fibers;E:expression of myogenin in ELSCs;F:magnification of E;G:expression of myogenin in MSCs;H:magnification of G;I:no expression of MyoD in MSCs;J:no expression of MyoD in ELSCs.A，E，G，I，J:×40;B，F，H:×100;C，D:×400.圖3 在成肌誘導液中培養10 d的ELSCs和MSCs肌細胞特異性抗原標志的表達

Figure 4.The RT－PCR results for mRNA expression of muscle－specific markers in ELSCs and in MSCs cultured in myogenic differentiation medium for 10 d.M:2 000 bp DNA marker;1:myogenin expression in MSCs;2:myogenin expression in ELSCs;3:negative control for myogenin;4:MHC expression in MSCs;5:MHC expression in ELSCs;6:negative control for MHC;7:no expression of MyoD in MSCs;8:no expression of MyoD in ELSCs;9:no expression of MHC in noninduced ELSCs;10:GAPDH expression in MSCs.圖4 肌細胞特異性抗原標志基因在誘導培養10 d的ELSCs和MSCs表達的RT－PCR結果

討 論

1 ELSCs的分離擴增

Battula等［8］采用胚胎干細胞的擴增培養方法從骨髓中分離到表達多潛能干細胞標志的細胞，并證明這些細胞可以在體外誘導向脂肪、骨、胰島細胞分化。按照該方法，本研究采用無血清培養基(含20%SR、2 mmol/L L－glutamine、1%NEAA、0.1 mmol/L 2 － mercaptoethanol和 5 μg/L bFGF 的Knockout－DMEM培養液)從成體骨髓中分離到形態纖細均一的SLECs，與運用傳統的含血清培養基分離到的MSCs在形態上具有明顯區別，而且ELSCs微弱表達多潛能抗原標志Oct－4、Nanog－3和 Sox－2，與 Battula等［8］的結果一致。無血清培養基一直是用來擴增人胚胎干細胞的專用培養基，牛血清的加入將導致胚胎干細胞的分化［10］。運用胚胎干細胞的擴增方法來擴增骨髓干細胞是個很有創意的思路。其他學者的研究［5］也證明采用含EGF等細胞因子的無血清培養基可從臍血中分離到體積較小的ELSCs。這些研究均支持了成體組織中存在ELSCs的觀點。成體組織中存在的ELSCs，多數學者［6，11－12］認為是胚胎發育過程中遺留下來的原始干細胞，這些干細胞因印記基因的表觀遺傳改變而處于靜息狀態，是組織器官再生的備份細胞，對維持機體內環境的穩定發揮著重要作用。bFGF是維持人胚胎干細胞自我更新而不分化的強刺激因子［13］，也是維持造血干細胞長期保持增殖能力的重要因子［14］。本研究中ELSCs很可能就是骨髓中極少數原始干細胞擴增的結果。

2 ELSCs的成肌誘導分化

5－氮雜胞苷通常用作干細胞的成肌分化誘導劑［15－16］，其作用機制一直被認為是由于DNA甲基化導致成肌調節因子的激活［17］。由于DNA的甲基化可能導致細胞癌變，因此，含有5－氮雜胞苷的培養液并不適于干細胞誘導。此外，有報道顯示5－氮雜胞苷不能誘導人骨髓來源的MSCs分化形成肌管［9，18］。在本研究中，采用添加了rhEGF而不含有5－氮雜胞苷的成肌分化誘導液培養ELSCs和MSCs 3 d，即可將2種細胞誘導為多核肌纖維，細胞呈長條狀，具有多個細胞核，完全符合肌纖維的典型特征，表明不含5－氮雜胞苷的肌細胞生長培養液是一種安全高效的成肌分化誘導液。誘導10 d的細胞MHC表達率最高，這個結果其實反映了肌管形成的規律，即肌細胞相互融合形成多核肌管，肌管具有自發收縮功能而從培養瓶中脫落，因此隨著誘導培養時間延長，免疫染色就檢測不到陽性表達的脫落細胞。有趣的是，有報道結果顯示由于rhEGF具有促進細胞增殖的作用，因此rhEGF的存在會負調控干細胞的成肌分化［19］。很顯然，本研究中rhEGF的存在并沒有影響細胞的成肌分化，可能原因包括:(1)分離擴增的培養體系不同，導致不同實驗中所用的干細胞生物學特性差異很大，其成肌分化結果自然也就不相同;(2)誘導培養體系組成成分不同，誘導結果可能就不相同;(3)rhEGF的作用機制復雜，不同時點加入，單獨使用或與其它因子聯合使用的結果不同甚至相反都是可能的。我們不知道為什么在本研究中沒有檢測到MyoD的表達，一個可能的解釋就是由于rhEGF的存在影響了MyoD的表達。更重要的是在同等條件下，雖然MSCs也可被誘導為MHC和myogenin陽性的多核肌纖維，但ELSCs的成肌分化率顯著高于MSCs，表明ELSCs具有更強的成肌分化能力。ELSCs的成肌分化能力優于MSCs的一個重要原因在于:無血清培養體系非常有利于骨髓中原始干細胞的增殖生長，最大程度地保持了多潛能干細胞的干性(stemness)，即最大程度地保持了其原本就有的分化潛能。而來自于相同骨髓的MSCs，含血清的培養體系很容易促使多潛能干細胞的分化，很大程度上丟失了原始干細胞的干性。這個研究結果還提示:應該進一步思考什么樣的細胞才是骨髓中的真正干細胞。最近Bhartiya等［20］提出:成體組織中真正的干細胞是VSELs這樣的多潛能干細胞(pluripotent stem cells)，MSCs和造血干細胞其實都是多潛能干細胞增殖分裂產生的祖干細胞(progenitor stem cells)。這里VSELs與本文中ELSCs本質上屬于同一類細胞，只是命名不同罷了。他還認為:過去眾多自體干細胞治療試驗效果欠佳的重要原因就是移植的是祖干細胞，而不是具有最大再生潛能的多潛能干細胞。有的學者［12］更進一步認為MSCs更恰當的名稱是間充質基質細胞(mesenchymal stromal cells)，因為其主要作用不是再生，而是其旁分泌機制發揮的免疫調節功能。盡管ELSCs與MSCs之間的關系尚需進一步深入研究，但本研究結果至少為肌營養不良癥等肌病的干細胞治療提供了種子細胞選擇的思路，為這些疾病的治療帶來了新的希望。

［1］劉正山，張 成.Mdx小鼠細胞治療的種子細胞及移植途徑研究現狀［J］.國際遺傳學雜志，2008，31(1):31－35.

［2］Reyes M，Lund T，Lenvik T，et al.Purification and exvivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells［J］.Blood，2001，98(9):2615 －2625.

［3］D'Ippolito G，Diabira S，Howard GA，et al.Marrow －isolated adult multilineage inducible(MIAMI)cells，a unique population of postnatal young and old human cells with extensive expansion and differentiation potential［J］.J Cell Sci，2004，117(14):2971 －2981.

［4］Kucia M，Reca R，Campbell FR，et al.A population of very small embryonic－like(VSEL)CXCR4+SSEA－1+Oct－4+stem cells identified in adult bone marrow［J］.Leukemia，2006，20(5):857－869.

［5］McGuckin C，Jurga M，Ali H，et al.Culture of embryonic－like stem cells from human umbilical cord blood and onward differentiation to neural cells in vitro［J］.Nat Protoc，2008，3(6):1046 －1055.

［6］Ratajczak MZ，Liu R，Ratajczak J，et al.The role of pluripotent embryonic－like stem cells residing in adult tissues in regeneration and longevity［J］.Differentiation，2011，81(3):153－161.

［7］Watts AE，Yeager AE，Kopyov OV，et al.Fetal derived embryonic－like stem cells improve healing in a large animal flexor tendonitis model［J］.Stem Cell Res Ther，2011，2(1):4－10.

［8］Battula VL，Bareiss PM，Treml S，et al.Human placenta and bone marrow derived MSC cultured in serum－free，b－FGF－containing medium express cell surface frizzled－9 and SSEA－4 and give rise to multilineage differentiation［J］.Differentiation，2007，75(4):279－291.

［9］Chan J，O’Donoghue K，Gavina M，et al.Galectin－1 induces skeletal muscle differentiation in human fetal mesenchymal stem cells and increases muscle regeneration［J］.Stem cells，2006，24(8):1879 －1891.

［10］胡智興，耿菊敏，梁道明.肝細胞生長因子促進人胚胎干細胞向神經前體細胞分化［J］.中國病理生理雜志，2010，26(4):730－736.

［11］Castro RF，Jackson KA，Goodell MA，et al.Failure of bone marrow cells to transdifferentiate into neural cells in vivo［J］.Science，2002，297(5585):1299 －1303.

［12］Rodgerson DO，Harris AG.A comparison of stem cells for therapeutic use［J］.Stem Cell Rev，2011，7(4):782 －796.

［13］Yeoh J，Os RV，Weersing E，et al.Fibroblast growth factor－1 and －2 preserve long－term repopulating ability of hematopoietic stem cells in serum － free cultures［J］.Stem Cells，2006，24(6):1564 －1572.

［14］Solchaga LA，Penick K，Porter JD，et al.FGF－2 enhances the mitotic and chondrogenic potentials of human adult bone marrow － derived mesenchymal stem cells［J］.J Cell Physiol，2005，203(2):398－ 409.

［15］Wakitani S，Saito T，Caplan AI.Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5－ azacytidine［J］.Muscle Nerve，1995，18(12):1417－1426.

［16］Gang EJ，Jeong JA，Hong SH，et al.Skeletal myogenic differentiation of mesenchymal stem cells isolated from human umbilical cord blood［J］.Stem Cells，2004，22(4):617－ 624.

［17］Santi DV，Norment A，Garrett CE，et al.Covalent bond formation between a DNA－cytosine methyltransferase and DNA containing 5 － azacytosine［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1984，81(22):6993－ 6997.

［18］Martin RE，Sweeney D，Lu F，et al.5－Azacytidinetreated human mesenchymal stem/progenitor cells derived from umbilical cord，cord blood and bone marrow do not generate cardiomyocytes in vitro at high frequencies［J］.Vox Sang，2008，95(2):137－148.

［19］Muguruma Y，Reyes M，Nakamura Y，et al.In vivo and in vitro differentiation of myocytes from human bone marrow －derived multipotent progenitor cells［J］.Exp Hematol，2003，31(12):1323 －1330.

［20］Bhartiya D，Shaikh A，Nagvenkar P，et al.Very small embryonic－like stem cells with maximum regenerative potential get discarded during cord blood banking and bone marrow processing for autologous stem cell therapy［J］.Stem Cells Dev，2012，21(1):1－6.