Twist基因沉默對人胃癌SGC7901細胞凋亡的影響

劉洪義 邢 金 所 劍 (天津市南開醫院，天津 30000)

Twist基因沉默對人胃癌SGC7901細胞凋亡的影響

劉洪義 邢 金1所 劍2(天津市南開醫院，天津 300100)

目的 探討Twist基因沉默對人胃癌SGC7901細胞凋亡的影響。方法 以本課題組穩定轉染pGenesil-Twist質粒的人胃癌SGC7901細胞作為研究對象，實驗分為三組:對照組、空載體組、Twist基因沉默組。通過倒置顯微鏡和透射電鏡觀察Twist基因沉默對SGC7901細胞形態的影響;通過Rhodamine123染色后流式細胞儀檢測各組細胞線粒體跨膜電位的變化;采用DAPI染色和TUNEL法觀察Twist基因沉默對SGC7901細胞凋亡情況的影響。結果 與對照和空載體組相比，倒置顯微鏡下觀察顯示基因沉默組細胞生長緩慢，細胞形態發生明顯改變，有較多細胞呈圓形，細胞異型性小;透射電鏡觀察顯示Twist基因沉默組細胞體積變小，微絨毛減少，細胞突觸變短且增多，空泡增多，核質比例降低，異染色質團塊狀分布，核周間隙更大;Rhodamine123染色后流式細胞儀檢測結果顯示Twist基因沉默組陰性細胞數增高;DAPI染色結果顯示細胞核邊緣不規則，染色質凝集，著色較重，核固縮，核小體碎片增加;TUNEL法檢測顯示Twist基因沉默組可見明顯細胞核棕黃色染色的陽性細胞。結論 Twist基因沉默促進SGC7901細胞凋亡，提示Twist在胃癌惡性進展中起重要作用，Twist可能成為腫瘤基因治療的靶點。

胃癌;RNAi;Twist基因;凋亡

研究發現，黑色素瘤、橫紋肌肉瘤、前列腺癌、胃癌、甚至胰腺癌等惡性腫瘤中Twist明顯高表達〔1～5〕，Twist異常高表達可能引起腫瘤。多數學者認為Twist是癌基因，能調節腫瘤細胞的凋亡、侵襲和轉移，在腫瘤的發生發展過程中發揮重要的作用〔6，7〕。本課題組研究發現〔5〕，Twist在人胃癌SGC7901細胞與胃黏膜上皮GES-1細胞相比表達顯著增高，表明Twist可能參與胃癌的發生發展過程。通過對穩定轉染pGenesil-Twist質粒的SGC7901細胞的生長活力的研究發現，Twist基因沉默可抑制SGC7901細胞的增殖，本研究將在此基礎上進一步探討抑制細胞增殖的機制，從而明確Twist基因在胃癌發生發展中發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌SGC7901細胞由吉林大學中日聯誼醫院中心實驗室惠贈;穩定轉染pGenesil-Twist質粒的SGC7901細胞由本實驗室建立;RPMI1640培養液購于Invitrogen公司;小牛血清購自杭州四季青公司;In situ cell death detection kit購于德國ROCHE公司;DAPI和Rhodamine123購于美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 SGC7901細胞株和穩定轉染pGenesil-Twist質粒的SGC7901細胞培養于含10%小牛血清RPMI1640的培養液中，在5%CO2、37℃細胞培養箱中恒溫培養。

1.2.2 細胞分組 根據轉染的質粒不同，將細胞分為對照組、空載體組、Twist基因沉默組。

1.2.3 倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態變化 細胞分組后，將對數生長期細胞接種于24孔板培養至約90%融合時，倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化并拍攝照片。

1.2.4 透射電鏡檢測細胞超微結構變化 將對數生長期細胞在細胞培養瓶中培養至90%融合，0.25%胰酶消化收集細胞，取106～107個細胞，1 000 r/min，離心5 min，使細胞形成微團，0.1 mol/L PBS洗滌細胞3次，1 000 r/min，離心5 min，使細胞形成致密微團，細胞團先用4%戊二醛固定，再用1%鋨酸固定，梯度乙醇脫水，Epon812環氧樹脂包埋，LKB-NOVA型超薄切片機切片，醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色，最后HITACHI H-7650型透射電鏡觀察并拍攝照片。

1.2.5 線粒體跨膜電位檢測 將對數生長期細胞接種于6孔板培養至約70%融合時，計數各組細胞，取1×106細胞置于1.5 m l EP管中，PBS洗3次，在500μl體系中加入終濃度為2 μmol/L Rhodamine123于細胞中，37℃，5%CO2孵育30 min，流式細胞儀檢測并分析結果。

1.2.6 DAPI染色 將DAPI染液用甲醇稀釋10～20倍，制成2μg/ml的DAPI工作液。將培養至90%融合的各組細胞棄去培養液，加入500μl DAPI工作液洗一次，再加入500μl的DAPI工作液37℃染色15 min，離心棄去染色液，甲醇漂洗一次，滴加Buffer A，熒光顯微鏡下觀察，拍攝照片，并統計各組中的陽性細胞，在高倍鏡下各組細胞選取20個視野，計數每個視野中細胞核著色強陽性的細胞數。

1.2.7 TUNEL原位細胞凋亡檢測 按試劑盒(In situ cell death detection kit，POD)說明配制TUNEL反應液。采用多聚賴氨酸處理蓋玻片防止細胞脫片，將高壓滅菌后的蓋玻片放入孔板中，分組接種細胞，待細胞90%融合時，取出蓋玻片進行后續試驗，梯度酒精水化后，PBS沖洗2次，每次3 min，蛋白酶 K(20 μg/m l，10 mmol/L Tris/HCl，pH 7.4 ～8.0，21℃ ～37℃消化15～30 min)消化，PBS沖洗2次，每次3 min，每片加50μl的0.3%H2O2甲醇溶液，阻斷內源性過氧化物酶，PBS沖洗，每片加25～50μl的TUNEL反應液，37℃孵育盒中孵育60 min，PBS沖洗，每片加25～50μl的辣根過氧化物酶抗體37℃，孵育盒中孵育60 min，PBS沖洗，每片加一滴新鮮配制的DAB室溫孵育5～10 min，鏡下觀察到細胞核呈現棕黃色的陽性細胞時終止反應，PBS沖洗，蘇木精復染，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.3 統計學分析 應用SPSS12.0統計軟件，采用方差分析法檢測各組實驗數據差異。

2 結果

2.1 倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化 對照和空載體組細胞生長較快，細胞形態不規則，異型性大，培養基中未見明顯懸浮的死細胞，而基因沉默組細胞生長緩慢，細胞形態發生明顯改變，有較多細胞呈圓形，細胞異型性小，培養基中可見明顯懸浮的死細胞，提示Twist基因沉默使SGC7901細胞生長緩慢，形態發生變化。見圖1。

2.2 透射電鏡下觀察細胞的超微結構變化 與對照和空載體組細胞相比，Twist基因沉默后細胞體積變小，微絨毛減少，細胞突觸變短且增多，排列紊亂，空泡增多，核質比例降低，髓樣小體增多，內質網顯著擴張，異染色質團塊狀分布，核周間隙更大，線粒體髓鞘樣變化尤為顯著。結果提示Twist基因沉默可能使SGC7901細胞發生凋亡。見圖2。

2.3 Twist基因沉默對SGC7901細胞線粒體膜電位的影響與對照組〔(4.4±0.9)%〕和空載體組〔(4.9±1.2)%〕相比，Twist基因沉默組陰性細胞數〔(14.0±0.9)%〕顯著增高(P＜0.001)，提示Twist基因沉默可能促使SGC7901細胞凋亡。見圖3。

圖1 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(×400)

圖2 透射電鏡下觀察細胞超微結構

圖3 線粒體跨膜電位流式細胞儀分析圖

2.4 DAPI染色檢測Twist基因沉默對SGC7901細胞的影響對照和空載體組細胞核呈圓形，邊緣清晰，染色均勻，而基因沉默組細胞核邊緣不規則，染色質凝集，著色較重，并且有核固縮現象。見圖4。Twist基因沉默組細胞核著色強陽性細胞數明顯高于對照和空載體組(P＜0.001)。提示Twist基因沉默促進SGC7901細胞凋亡。

圖4 細胞凋亡DAPI染色(×400)

2.5 TUNEL法檢測Twist基因沉默對SGC7901細胞的影響Twist基因沉默組細胞可見有明顯細胞核呈棕黃色染色的陽性細胞，此細胞即凋亡細胞，而對照和空載體組較少見陽性細胞。見圖5。對照組和空載體組陽性細胞數分別為14.5±3.8和15.2±2.1，Twist基因沉默組陽性細胞數為35.1±8.2，與對照和空載體組相比，Twist基因沉默組陽性細胞數增高(P＜0.001)。提示Twist基因沉默促進SGC7901細胞凋亡。

圖5 TUNEL法檢測各組細胞凋亡情況

3 討論

近年來的研究發現Twist和腫瘤的發生有關，有報道認為Twist基因是一個原癌基因，能通過不同的途徑抑制細胞的凋亡〔4，8〕，與腫瘤侵襲、轉移和增殖相關。Twist在黑色素瘤、前列腺癌、肝癌、胰腺癌等惡性腫瘤中表達明顯上調〔2，4，6，7〕。本課題組前期的研究發現Twist基因在胃癌SGC7901細胞高表達，且與細胞的增殖能力相關〔5〕，這與文獻報道相一致，本研究將在此基礎上進一步探討Twist抑制細胞增殖的機制，從而明確Twist基因在胃癌發生發展中所發揮的作用。研究發現Twist基因沉默SGC7901細胞后細胞生長緩慢，細胞形態發生明顯改變，有較多細胞呈圓形，細胞異型性小，透射電鏡觀察進一步顯示Twist基因沉默后細胞體積變小，微絨毛減少，細胞突觸變短且增多，空泡增多，核質比例降低，異染色質團塊狀分布，核周間隙更大。結果提示Twist基因沉默后SGC7901細胞出現凋亡，使增殖抑制。為了進一步證實Twist基因沉默后細胞是否發生凋亡，首先檢測細胞線粒體跨膜電位的改變，因為它是細胞凋亡級聯反應過程中最早發生的事件，在細胞核凋亡特征出現之前，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細胞凋亡不可逆轉。結果顯示Twist基因沉默組Rhodamine123陰性細胞數顯著增高，提示Twist基因沉默能夠降低細胞線粒體膜電位，細胞可能發生凋亡，進一步通過DAPI染色和TUNEL法檢測細胞的凋亡情況，結果提示Twist基因沉默后細胞發生凋亡。本研究結合文獻報道，證實Twist基因沉默促進細胞凋亡，揭示了Twist基因與胃癌的發生發展相關，Twist可能成為胃癌基因治療的靶點，但是Twist基因沉默促進細胞凋亡的確切機制還未明確，有待進一步探討。

1 Takei Y，Kadomatsu K，Yuzawa Y，et al.A small interfering RNA targeting vascular endothelial growth factor as cancer therapeutics〔J〕.Cancer Res，2004;64(10):3365-70.

2 Jinushi M，Nakazaki Y，Carrasco DR，et al.Milk fat globule EGF-8 promotesmelanoma progression through coordinated Akt and twist signaling in the tumormicroenvironmen〔t J〕.Cancer Res，2008;68(21):8889-98.

3 Hao L，Ha JR，Kuzel P，et al.Cadherin switch from E-to N-cadherin in melanoma progression is regulated by the PI3K/PTEN pathway through Twist and Snail〔J〕.Br JDermatol，2012;166(6):1184-97.

4 Ohuchida K，Mizumoto K，Ohhashi S，etal.Twist，a novel oncogene，is upregulated in pancreatic cancer:clinical implication of Twist expression in pancreatic juice〔J〕.Int JCancer，2007;120(8):1634-40.

5 劉洪義，孫 梅，所 劍.RNA干擾沉默Twist基因對人胃癌細胞系SGC7901細胞增殖能力的影響〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(7):826-8.

6 Kwok WK，Ling MT，Lee TW，et al.Up-regulation of TWIST in prostate cancer and its implication as a therapeutic target〔J〕.Cancer Res，2005;65(12):5153-62.

7 Zhu Q，Xu H，Xu Q，etal.Expression of Twistgene in human hepatocellular carcinoma cell strains of differentmetastatic potential〔J〕.JHuazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2008;28(2):144-6.

8 Maestro R，Dei Tos AP，Hamamori Y，et al.Twist is a potential oncogene that inhibits apoptosis〔J〕.Genes Dev，1999;13(17):2207-17.

R73

A

1005-9202(2012)16-3464-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.054

1 吉林省前衛醫院普外科 2 吉林大學第一醫院胃結直腸外科

所 劍(1957-)，男，主任醫師，教授，博士生導師，主要從事消化道腫瘤研究。

劉洪義(1972-)，男，主治醫師，主要從事消化道腫瘤研究。

〔2012-01-15收稿 2012-03-20修回〕

(編輯 徐 杰)