硫化氫對D-半乳糖所致大鼠心肌組織氧化應激和細胞凋亡的影響

許言午 張江虹 張麗娜 韓志芬 金國琴 (上海中醫藥大學基礎醫學院，上海 003)

硫化氫對D-半乳糖所致大鼠心肌組織氧化應激和細胞凋亡的影響

許言午 張江虹1張麗娜 韓志芬2金國琴 (上海中醫藥大學基礎醫學院，上海 201203)

目的觀察硫化氫對D-半乳糖所致大鼠心肌組織氧化應激及細胞凋亡的影響。方法雄性SD大鼠40只，隨機分為對照組、D-半乳糖組、硫化氫6.25μmol/kg組(H2S-1)，硫化氫12.5μmol/kg(H2S-2)組，每組10只。D-半乳糖組每日腹腔注射D-半乳糖400 mg·kg-1·d-1，連續60 d;對照組每日腹腔注射等體積生理鹽水;硫化氫組處理同D-半乳糖組，同時分別按6.25和12.5μmol/kg腹腔注射硫化氫。采用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸(TBA)法檢測心肌組織超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;采用Western印跡檢測Bcl-2和Bax蛋白表達水平并測定組織Caspase-3相對活性。結果與對照組相比，D-半乳糖組大鼠心肌組織SOD活性下降、MDA含量升高，Bcl-2蛋白表達下調、Bax蛋白表達上調，Caspase-3相對活性升高;給予硫化氫能顯著改善D-半乳糖所致大鼠心肌組織氧化應激水平，減少細胞凋亡。結論硫化氫可通過提高抗氧化能力和減少細胞凋亡緩解D-半乳糖所致心肌組織損傷。

硫化氫;心肌損傷;氧化應激;細胞凋亡;D-半乳糖

硫化氫(H2S)是近年發現的繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三種內源性氣體信號分子，在心血管系統發揮著重要的病理、生理作用〔1，2〕。大量的研究表明，H2S可通過抑制心肌細胞凋亡和減少氧化應激而減輕由缺血-再灌注或缺氧引起的急性心肌損傷〔3～5〕。本研究以D-半乳糖亞急性損傷大鼠為模型，觀察H2S對亞急性中毒引起的心肌組織氧化應激和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級雄性SD大鼠，2月齡，體重(250±10)g。由上海中醫藥大學實驗動物中心提供〔動物許可證號:SCXK(滬)2007-0005〕。

1.2 試劑 硫氫化鈉 (NaHS):Sigma公司;D-半乳糖:國藥集團化學試劑有限公司 (Cat.No.63004434);超氧化物歧化酶 (SOD)檢測試劑盒、丙二醛 (MDA)測定試劑盒、蛋白定量Bradford試劑盒:南京建成生物工程研究所;Caspase-3活性檢測試劑盒:BioVision公司 (Cat.No.K106-100);兔抗大鼠 Bcl-2抗體、Bax抗體:Cell Signalling公司:(Cat.No.2870，Cat.No.2772);兔抗大鼠 β-actin抗體、HRP標記山羊抗兔抗體:Abmart公司 (Cat.No.P30002，Cat.No.M21003);親水蛋白分離試劑盒:普利萊基因技術有限公司 (Cat.No.P1250);BCA蛋白質定量試劑盒及超敏ECL試劑盒:Pierce公司 (Cat.No.23225)。其他常用試劑均為分析純:國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 儀器 組織超聲破碎儀(美國Misonix公司);酶聯免疫測定儀(美國MD公司);蛋白質電泳、半干轉印系統(上海天能科技有限公司);G:BOX凝膠分析系統(英國Syngene公司)。

1.4 方法

1.4.1 動物分組、造模與給藥 40只大鼠，隨機分為4組:對照組、D-半乳 糖組、H2S-1(6.25 μmol/kg)組 和 H2S-2(12.5μmol/kg)組，每組10只。溫度18℃ ～22℃，光暗周期12 h∶12 h，群養，5 只/籠，常規喂養飼料，自由飲水。D-半乳糖組每日腹腔注射D-半乳糖400mg·kg-1·d-1，連續60 d;對照組每日腹腔注射等量生理鹽水;H2S-1組和H2S-2組處理D-半乳糖組，同時以NaHS為供體溶解于生理鹽水，每日分別按6.25μmol/kg和12.5μmol/kg腹腔注射H2S。

1.4.2 組織取材 大鼠腹腔麻醉(10%水合氯醛，400 mg/kg)，腹主動脈取血處死;取下心肌組織，生理鹽水洗凈，立即測定或分置于Eppendorf管中-70℃保存。

1.4.3 大鼠心肌組織SOD活性、MDA含量檢測 取左心室心肌組織，按100 mg/ml生理鹽水加入生理鹽水。于冰水浴中小彎剪剪碎，超聲破碎，使其充分裂解，4℃離心10 min后取上清，BCA法測定蛋白含量。其余操作按試劑盒說明書進行，并對測定結果進行蛋白含量校正。

1.4.4 大鼠心肌組織凋亡檢測

1.4.4.1 Western印跡檢測大鼠心肌組織Bcl-2和Bax蛋白表達 取左心室心肌組織，按100 mg/ml加入裂解液，裂解操作同1.4.3，后于4℃離心10 min，取上清，BCA法測定蛋白含量。然后進行電泳及Western印跡分析，其中蛋白上樣量調整為80 μg，一抗稀釋度為 1∶2 000，二抗稀釋度為1∶5 000。Western印跡結果采用Genesnap進行圖像采集，Image pro6.0分析軟件對條帶進行密度掃描，得出條帶密度值，以β-actin為內參照。

1.4.4.2 大鼠心肌組織Caspase-3相對活性測定 取大鼠左心室心肌組織50 mg，以100 mg/ml加入試劑盒提供的裂解液，制備組織勻漿，4℃離心5 min，取上清，以Bradford法進行蛋白定量。用稀釋液調整上清蛋白含量為2 mg/ml，其余按試劑盒說明書進行。以對照組活性為1，計算Caspase-3相對活性。

2 結果

2.1 硫化氫對D-半乳糖處理大鼠心肌組織SOD活性和MDA含量的影響 見表1。

2.2 硫化氫對D-半乳糖誘導的大鼠心肌組織Bcl-2、Bax表達及Caspase-3相對活性的影響 見表2，圖1。

表1 硫化氫對D-半乳糖處理大鼠心肌組織SOD活性和MDA含量的影響(±s，n=10)

表1 硫化氫對D-半乳糖處理大鼠心肌組織SOD活性和MDA含量的影響(±s，n=10)

與對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與D-半乳糖組比較:3)P＜0.05，4)P ＜0.01;下表同

組別 SOD活性(U/mg) MDA含量(nmol/mg)對照組 49.8±3.64) 2.14±0.374)H2 S-1組 41.2±3.72)3) 3.28±0.762)3)H2 S-2組 45.1±4.52)4) 2.72±0.361)4)D-半乳糖組 37.1±2.52) 3.85±0.562)

表2 硫化氫對D-半乳糖誘導的大鼠心肌組織Bcl-2、Bax蛋白表達和Caspase-3相對活性的影響(±s，n=10)

表2 硫化氫對D-半乳糖誘導的大鼠心肌組織Bcl-2、Bax蛋白表達和Caspase-3相對活性的影響(±s，n=10)

組別Bcl-2 Bax Caspase-3對照組 1.00±0.004) 1.00±0.004) 1.00±0.274)H2 S-1組 0.65±0.132)3) 1.52±0.132)4) 2.54±0.332)4)H2 S-2組 0.71±0.142)4) 1.18±0.131)4) 1.76±0.292)4)D-半乳糖組 0.37±0.112) 2.12±0.352) 3.04±0.552)

圖1 各組Bcl-2、Bax W estern印跡檢測

3 討論

D-半乳糖引起的亞急性中毒模型是目前被廣為使用的擬衰老模型。雖然其作用機制尚未完全明確，但根據衰老的代謝學說，D-半乳糖引起的糖代謝紊亂必然會導致心、肝、腎、腦等重要器官代謝異常，最終出現衰老〔6〕。同時，大量的研究顯示，D-半乳糖可通過代謝過程中產生的自由基引起氧化應激損傷〔7～9〕和細胞凋亡〔10，11〕。

長期以來，H2S一直被認為是污染環境的毒性氣體，是造成大氣和水以及某些職業病的主要危害物質之一。超過生理劑量的H2S對活體器官的毒性主要體現在對中樞神經系統以及對呼吸系統的抑制作用。然而，近年研究表明H2S不但在體內可以內源性生成〔12〕，而且在心血管系統發揮著重要的病理生理作用，被確定為繼NO和CO之后的第三種內源性氣體信號分子〔2〕。大量的研究表明，H2S預處理和后處理可以通過減少氧化應激損傷、抑制心肌細胞凋亡等機制有效減輕缺血-再灌注或缺氧引起的急性心肌損傷〔3～5〕。那么，H2S對亞急性和慢性損傷引起的心肌氧化應激和細胞凋亡的作用如何未見報道。本文結果說明，外源性給予H2S可通過增強SOD活性，降低MDA含量而減輕D-半乳糖所致大鼠心肌組織氧化應激損傷，同時可以通過上調Bcl-2和下調Bax的表達、降低Caspase-3的活性而減輕心肌細胞凋亡，從而發揮其心肌保護作用。然而H2S對上述指標作用的具體通路機制和內源性H2S/CSE系統在心肌組織衰老等慢性變化中的作用和機制還有待進一步研究。

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R285.5

A

1005-9202(2012)16-3471-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.057

上海市自然科學基金(10ZR1430000，09ZR1403600);上海高校選拔培養優秀青年教師科研專項基金(szy08007);上海市教育委員會重點學科建設項目(J50301)資助

1 復旦大學放射醫學研究所 2 上海中醫藥大學教學實驗中心

許言午(1974-)，男，博士，講師，主要從事中醫藥對老年病防治的研究。

〔2011-11-09收稿 2012-01-10修回〕

(編輯 曹夢園)