黃芩苷逆轉人肝癌細胞耐藥株Bel-7402/ADM多藥耐藥性的相關機制研究

王術華

黃芩苷逆轉人肝癌細胞耐藥株Bel-7402/ADM多藥耐藥性的相關機制研究

王術華

目的考察黃芩苷對人肝癌耐藥細胞Bel-7402/ADM多藥耐藥性的逆轉機制。方法MTT法考察Baicalin對人肝癌多藥耐藥細胞的逆轉作用。結果 Baicalin逆轉Bel-7402/ADM多藥耐藥性的機制可能與抑制MDR1部分基因產物P-gp、MRP、GSH/GST的表達和誘導細胞凋亡有關。結論Baicalin可能通過抑制MDR1部分基因產物P-gp、MRP、GSH/GST的表達和誘導細胞凋亡逆轉Bel-7402/ADM的多藥耐藥性。

黃芩苷;Bel-7402;多藥耐藥;逆轉

腫瘤治療由于長期使用化療藥物使患者的癌細胞對藥物產生耐受性即多藥耐藥性(MDR)。MDR的發生通常是由多種機制共同作用，如P-gp的外排泵機制［1-3］、GST的改變［4］等。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 黃芩苷(北京北納創聯生物技術研究院);鹽酸阿霉素(ADM)(浙江海正藥業股份有限公司);絲裂霉素(MMC)(協和發酵工業株式會社);Bel-7402、Bel-7402/AMD(購自中科院上海細胞生物學研究所);CO2培養箱、流式細胞儀(美國Coulter公司);倒置顯微鏡(日本Nikon公司);MTT、P-gp單抗、單抗羊抗鼠熒光標記杭體(美國Sigma公司)。

1.2 細胞的復蘇、培養 肝癌細胞Bel-7402培養于含10%小牛血清的 RPMI-1640培養液中，肝癌耐藥細胞株BEL7402/ADM培養于含10%小牛血清及0.3μg/m l的阿霉素的RPMI-1640培養液中，實驗一周前于無阿霉素的培養液中培養。

1.3 MTT法考察Baicalin對人肝癌多藥耐藥細胞的逆轉作用 細胞以1×106L的密度接種于96孔培養板中，孵育24h后，加入不同濃度的 ADM、MMC、DDP及Baicalin，繼續培養48h，然后加入 MTT液，培養5h后，加入10%SDS，37℃過夜，用酶標儀測定吸光度(OD值)。

1.4 流式細胞儀測定P-gp、MRP蛋白、GSH/GST表達 將未經Baicalin處理和經過Baicalin處理過的BEL-7402/ADM細胞制備成細胞懸液(細胞密度大于1×106個/ml)，PBS清洗兩遍，隨后分別加入P-gp、MRP、GSH/GST鼠抗人單克隆抗體，以鼠抗人isotype-matched單克隆抗體為內對照，4℃孵育1h后，再分別加入羊抗鼠熒光標記抗體。再于4℃下孵育30min，應用流式細胞儀對熒光度進行測定。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 每組收集5×105個細胞，用PBS溶液(含2%牛血清白蛋白)洗滌2次，分別加入FITC標記的AnnexinV和PI，避光放置1h后，流式細胞儀檢測，每次讀取10000個細胞，通過Cell Quest軟件進行數據分析。凋亡率(%)=(AnnexinV+PI+細胞數+AnnexinV+PI-細胞數)/100。

2 結果

2.1 黃芩苷對于Bel-7402/ADM多藥耐藥性的逆轉作用表1中AMD、MMC、VCR對Bel-7402/AMD的IC50均顯著低于Bel-7402/ADM經Baicalin處理的 IC50，可見Baicalin對Bel-7402/ADM的多藥耐藥性具有一定的逆轉作用。

表1 黃芩苷對Bel-7402/ADM多藥耐藥性的逆轉作用結果(±s，n=3)

表1 黃芩苷對Bel-7402/ADM多藥耐藥性的逆轉作用結果(±s，n=3)

注:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

藥物IC50/μmol/L Bel-7402/ADM Bel-7402 Bel-7402/ADM-Baicalin(100μmol/L)Bel-7402/ADM-Baicalin(200μmol/L)Bel-7402/ADM-Baicalin(300μmol/L)AMD 30.32±1.65 0.35±0.03 18.63±1.92 12.43±1.02* 4.79±0.42＊＊MMC 35.64±1.96 1.12±0.05 23.58±1.34 16.43±1.29* 6.82±0.38＊＊VCR 18.26±1.29 0.11±0.02 15.36±1.91 8.31±0.64* 7.65±0.66＊＊

2.2 流式細胞儀檢測Baicalin對Bel-7402/ADM中MDR1基因部分表達產物的影響 Bel-7402/ADM經Baicalin處理后，MDR1基因的表達產物P-gp、MRP、GSH/GST的表達均受到抑制，結果表明Baicalin逆轉Bel-7402/ADM多藥耐藥性的機制可能與抑制MDR1部分基因產物P-gp、MRP、GSH/GST的表達有關。

表2 流式細胞儀測定P-gp、MRP、GSH/GST熒光細胞的染色率

2.3 流式細胞儀檢測Baicalin對Bel-7402/ADM細胞凋亡的影響 圖1結果顯示，經Baicalin處理過的Bel-7402/ADM細胞對AMD的敏感性顯著提高，其細胞凋亡率最高。結果表明，Baicalin對Bel-7402/ADM多藥耐藥性的逆轉作用可能與誘導細胞凋亡有關。

圖1 流式細胞儀測定細胞凋亡率

3 小結

本文通過考察黃芩苷對Bel-7402/AMD的多藥耐藥性的逆轉情況研究，可知黃芩苷可以逆轉Bel-7402/AMD的多藥耐藥性其作用機制可能與MDR1部分基因產物的過度表達有關，競爭性的飽和細胞膜表面的P-gp通道可能是黃芩苷抑制P-gp的主要作用機制。

［1］ 李睿，徐海帆．多藥耐藥蛋白P-糖蛋白的研究進展．中國實用醫藥，2009，4(2):240．

［2］ 立彥，王自正．P-gp介導的腫瘤多藥耐藥逆轉研究進展．放射免疫學雜志，2005，18(2):133．

［3］ 陳永剛，汪選斌．川芎嗪逆轉腫瘤多藥耐藥的研究進展．中國藥房，2009，20(21):1675-1676．

［4］ 李映良，金先慶．谷胱甘肽-S-轉移酶與腫瘤多藥耐藥．兒科藥學雜志，2007，13(4):73-76．

Themultidrug-resistantmechanism study of reverse effect of Baicalin for hepatocellular carcinoma cell

line(Bel7402/ADM)

WANG Shu-hua．Panjin College of Vocational and Technical，Panjin 124010，China

ObjectiveTo study themechanism that Baicalin reverse MDR of Bel-7402.M ethods U-sing MTTmethord，analyse reverse effect of Baicalin on MDR of Bel-7402.Results Themechanism which Baicalin reversed the multidrug resistance of Bel-7402/ADM may be associated with inhibition part of the gene product of MDR1，such as P-gp，MRP and GSH/GST over-expression and induction of apoptosis．Conclusion

Baicalin may reverse Bel-7402/ADM in multidrug resistance by inhibiting over-expression of part of the gene product in MDR1(P-gp、MRP and GSH/GST)and induced cells apoptosis．

Baicalin;Bel-7402;MDR;Reverse

124010盤錦職業技術學院