阿托伐他汀對氧化型低密度脂蛋白刺激下脂肪細胞分泌功能的影響

謝湘竹，趙水平，于碧蓮，鐘巧青

目前認為，炎性反應參與了動脈粥樣硬化的發生發展過程［1］。脂肪細胞和脂肪組織不僅參與脂質和能量代謝，而且還參與了炎性反應，兩者在動脈粥樣硬化形成過程中的作用極其重要。氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)具有致動脈粥樣硬化作用，還在局部慢性炎性反應中起一定的作用［2］。他汀類藥物具有獨立于降膽固醇以外的多效性作用［3-5］。本文旨在研究阿托伐他汀對oxLDL刺激狀態下脂肪細胞炎性因子表達的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 3T3-L1前脂肪細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院，高糖DMEM培養基購自美國Sigma公司，胰蛋白酶購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰島素、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、oxLDL購自美國Sigma公司，阿托伐他汀原粉由北京紅惠制藥公司饋贈，TRIzol購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒購自美國Promega公司，引物由北京奧科生物技術有限責任公司合成，核因子-κB(NF-κB)活性檢測試劑盒購自Active Motif公司。

1.2 方法

1.2.1 3T3-L1前脂肪細胞培養、誘導分化與鑒定:根據3T3-L1前脂肪細胞培養和誘導分化方案［6］，用完全培養基(高糖DMEM+10%胎牛血清)在37℃、5%CO2培養箱中培養細胞，2 d換液1次。待細胞生長至完全融合后2 d(第0天)時開始誘導分化，將培養液換成含0．5 mmol/L IBMX、0．25 μmol/L 地塞米松和10 mg/L胰島素的完全促分化液。48 h后，撤去IBMX和地塞米松，換成只含有10 mg/L胰島素的促分化液，2 d換液1次。至第9天，＞95%的3T3-L1細胞分化成為成熟脂肪細胞，經油紅O染色法鑒定，顯微鏡下脂肪細胞中脂滴呈亮紅色。

1.2.2 藥物干預:脂肪細胞分化成熟后，用含0．2%去脂肪酸牛血清白蛋白(BSA)的無血清培養液饑餓療法24 h后，分別用不同濃度阿托伐他汀(0、0．1、1．0、10．0 μM)干預，18 h 后，再加入含50 μg/ml ox-LDL培養基孵育1 h。提取培養上清液及細胞，－70℃凍存備用。饑餓療法后未予任何干預的脂肪細胞為空白對照組。

1.2.3 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)濃度測定:使用小鼠TNF-α酶聯免疫(ELISA)試劑盒，按說明測定脂肪細胞培養上清液中TNF-α的濃度。

1.2.4 TNF-α及過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)mRNA表達水平的測定:用TRIzol一步法提取總RNA，應用巢式逆轉錄聚合酶鏈反應(RTPCR)法檢測 TNF-α及 PPAR-γmRNA表達水平。TNF-α引物序列為:上游 5'-GCCACCACGCTCTTCTG-3'，下游 5'-GGTGTGGGTGAGGAGCA-3'，產物342 bp;PPAR-γ引物序列為:上游5'-TGGAGCCTAAGTTTGAGTTTGC-3'，下游為 5'-TGACGATCTGCCTGAGGTCTG-3'，產物249 bp;內參GAPDH引物序列為:上游 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，產 物 439 bp。PCR擴增條件為:94℃預變性3 min，94℃變性50 s，50℃(TNF-α)、56℃(PPAR-γ)、58℃(GAPDH)退火1 min，72℃ 延伸 1 min，循環 36 次，72℃ 終末延伸10 min。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳成像后，分析各組目的基因及GAPDH基因灰度值，以兩者的比值代表TNF-α和PPAR-γmRNA的表達水平。

1.2.5 核蛋白提取及NF-κB活性檢測:使用細胞核蛋白和細胞漿蛋白抽提試劑盒提取核蛋白，BCA法定量，－70℃保存備用，ELISA檢測NF-κB活性。

1.3 統計學方法 應用SPSS 12．0軟件包進行統計分析，主要統計指標均進行正態性檢驗，計量資料以均數±標準差表示，多個樣本間比較采用Oneway ANOVA檢驗，LSD方法進行。主要實驗數據來自3次以上重復實驗，α=0．05為檢驗水準。

2 結果

2.1 TNF-α濃度 oxLDL刺激使3T3-L1脂肪細胞分泌TNF-α增加，而阿托伐他汀呈濃度依賴性抑制oxLDL刺激下脂肪細胞 TNF-α的分泌。50μg/ml oxLDL刺激下 TNF-α的分泌水平為(8．93±3．26)pg/ml，在0．1、1．0、10．0 μM 阿托伐他汀的干預下，oxLDL刺激下脂肪細胞TNF-α的分泌水平分別為(6．72 ±2．59)pg/ml，(4．68 ±1．31)pg/ml，(4．09 ±1．42)pg/ml。與 oxLDL 刺激組比較，1．0及10．0 μM阿托伐他汀干預組TNF-α水平均降低，差異有統計學意義(P ＜0．05)。10．0與0．1 μM 阿托伐他汀干預組比較差異有統計學意義(P＜0．05)。見圖1。

圖1 不同濃度阿托伐他汀對TNF-α分泌的影響

2.2 TNF-αmRNA表達 與空白對照組比較，50μg/ml oxLDL刺激使 3T3-L1脂肪細胞 TNF-α mRNA 表達水平增高2．9 倍(0．633 ±0．157 vs0．218 ±0．078，P ＜0．001)。阿托伐他汀呈劑量依賴性抑制oxLDL刺激下脂肪細胞TNF-αmRNA表達，與ox-LDL刺激組比較，1．0和10．0μM阿托伐他汀的干預分別使脂肪細胞TNF-αmRNA的表達降低48．8%和56．5%(0．324 ± 0．098 vs 0．633 ± 0．157;0．275 ±0．097 vs 0．633 ±0．157，P ＜0．05)。10．0 與0．1 μM阿托伐他汀干預組比較差異有統計學意義(0．275±0．097 vs 0．502 ± 0．157，P ＜0．05)。見圖2。

圖2 不同濃度阿托伐他汀對TNF-αmRNA表達水平的影響

2.3 NF-κB活性 與空白對照組比較，50μg/ml oxLDL 刺激使NF-κB 活性增加1．65 倍(4．08 ±0．87 vs 1．54±0．44，P ＜0．05)。阿托伐他汀呈劑量依賴性抑制 oxLDL 刺激下 NF-κB 的活性。0．1、1．0 及10．0μM阿托伐他汀干預后，NF-κB活性分別為3．69± 0．79、2．93 ± 0．62 和 2．39 ± 0．51，其中10．0μM阿托伐他汀的干預使 NF-κB活性降低41．2%，與oxLDL刺激組比較，差異有統計學意義(P ＜0．05)。10．0與0．1 μM 阿托伐他汀干預組比較差異有統計學意義(P＜0．05)。見圖3。

圖3 不同濃度阿托伐他汀對NF-κB活性的影響

2.4 PPAR-γmRNA表達 PPAR-γmRNA在分化成熟的3T3-L1脂肪細胞有較高水平的表達。與空白對照組比較，oxLDL刺激1 h PPAR-γmRNA表達水平無明顯變化(P＞0．05)。與oxLDL刺激組比較，0．1及1．0 μM 阿托伐他汀干預后 PPAR-γ mRNA 表達輕度升高(1．51 ±0．64 vs 1．03 ±0．44，2．23 ±0．69 vs 1．03 ±0．44，P ＞0．05)，而 10．0 μM阿托伐他汀的干預使PPAR-γmRNA的表達增加2．83倍(2．92 ± 0．96 vs 1．03 ± 0．44，P ＜ 0．001)。10．0與0．1μM阿托伐他汀干預組比較差異有統計學意義(P＜0．05)。見圖4。

圖4 不同濃度阿托伐他汀對PPAR-γmRNA表達水平的影響

3 討論

動脈粥樣硬化是一種炎性疾病［7］。脂肪組織是低水平慢性炎性狀態的重要決定因素［8-9］，可能與肥胖及其并發癥的進展有關［10-11］。有研究發現，高膽固醇血癥兔脂肪細胞TNF-α的分泌水平及皮下脂肪組織TNF-αmRNA的表達水平均明顯增高［12-13］，且體外使用脂多糖(LPS)刺激脂肪細胞后其分泌的TNF-α水平亦明顯增高［14］。目前研究發現，LDL及ox-LDL均能明顯刺激人單核/巨噬細胞TNF-α的表達［13，15］，具有明顯的促炎效應。本研究結果提示，oxLDL刺激也能造成脂肪細胞的體外炎性狀態。阿托伐他汀的抗炎效應已經得到肯定，并且認為，阿托伐他汀的抗動脈粥樣硬化作用與其抗炎效應密切相關。本研究發現，阿托伐他汀呈濃度依賴性抑制ox-LDL刺激下脂肪細胞TNF-α的分泌及表達。

阿托伐他汀抑制脂肪細胞分泌TNF-α的確切分子機制目前仍不十分清楚。大量研究顯示，他汀類的抗炎作用并不依賴于其對膽固醇水平的降低［3-5］。已有研究表明，阿托伐他汀及普伐他汀均能激活人單核細胞 PPAR-γ，抑制 NF-κB 活性，減少 TNF-α 的分泌［16-17］，本研究觀察了阿托伐他汀對3T3-L1脂肪細胞PPAR-γ表達及NF-κB活性的直接影響，結果與報道一致。提示PPAR-γ與NF-κB等可能介導了他汀類藥物對單核細胞炎性過程的調節。

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